影响因子：6
研究概述：低级别胶质瘤（LGG）被认为是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤之一，包括WHO定义的II级和III级胶质瘤。除了传统疗法外，新兴的基因编辑系统也越来越受到关注。CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物基因组中，是一种进化为应对病毒和质粒入侵的获得性免疫防御机制。该系统主要由Cas9蛋白和单链向导RNA（sgRNA）组成。Cas9蛋白在sgRNA的引导下识别特定的DNA序列，通过碱基互补配对原理切割不同的靶位点，从而实现DNA双链的断裂。Hippo通路的异常信号传导还与多种病理过程有关，包括癌症和免疫相关疾病。YAP/TAZ是Hippo通路下游的主要转录共激活因子。在本研究中，作者利用CRISPR-cas9在内的多种生物信息学工具识别了与Hippo信号通路相关的基因及其对癌症风险的潜在影响。具体研究如下：
本文的亮点是使用了Depmap数据库的CRISPR-cas9 screening data，得到的基因是与细胞增殖显著相关的基因，与直接用Hippo通路效果更好。其他的分析则都很普通。
结合Depmap数据库进行生信分析，欢迎交流！
研究结果：
确定低级别胶质瘤中功能基因组
作者首先寻找LGG差异表达基因（图A）。接着，作者还探究了癌基因根据其对其他基因的依赖性的得分（分数越低，代表敲除该基因对细胞增殖抑制效果越好）。作者把所有胶质瘤细胞系中依赖性得分低于-0.5的基因与在TCGA中上调的基因相交，最终得到145个基因。还把所有胶质瘤细胞系中依赖性得分高于0.5的基因与在TCGA中下调的基因相交，获得了6个基因（图C）。这145个基因被指定为癌基因。在GO分析中，富集水平最高的三个通路为纺锤体组织、剪接体复合物和核糖核蛋白复合物结合（图D）。而KEGG分析结果表明这些癌基因在细胞周期、Hippo信号通路和其他通路中存在富集（图E）。
基因特征的创建和验证
接下来，在Lasso回归模型的计算下，共筛选出19个基因并用于构建风险评分。在内部训练数据集中，以0.752324的中位风险评分作为阈值，将患者分为低风险组和高风险组，其他验证数据集中也使用了相同的阈值。在建模集中，低风险组患者的总体生存（OS）明显优于高风险组患者。生存曲线的分析结果表明，具有高风险特征的LGG患者3年生存率约为56.34% [47.18–67.3%]。低风险特征的LGG患者3年生存率约为97.2% [93.9–100%]。在高风险LGG患者中，5年生存率约为37.58% [27.45–51.4%]，明显低于低风险LGG患者的89.3% [78.86–100%]；10年生存率在高风险LGG患者中约为12.54% [5–31.4%]，而低风险LGG患者则约为65.1% [43.50–97.3%]。根据不同时间段的ROC曲线分析结果，1、3和5年的AUC分别为0.865、0.910和0.874。在内部验证数据集中，从Kaplan–Meier曲线观察到高风险组患者的OS时间显著短于低风险组患者，具有统计学显著性差异（p值 < 0.05）。生存曲线的分析结果显示，高风险LGG患者的3年和5年生存率分别约为60.3% [47.2–76.9%]和36.3% [20.4–64.5%]。在低风险LGG患者中，3年和5年的生存率分别约为89.1% [79.2–100%]和62.6% [44.0–89.0%]。对1、3和5年的ROC曲线分析得到的AUC值分别为0.861、0.878和0.690。
并且在整个TCGA-LGG数据集中（图A、B，p值 < 0.001，HR: 1.060，95% CI 1.036–1.085）以及外部验证CGGA-LGG数据集中（图C、D，p值 < 0.05，HR: 1.016，95% CI 1.003–1.029）和GEO-LGG数据集中（图E、F，p值 < 0.001，HR: 1.171，95% CI 1.074–1.276），风险评分被证明是一个独立的预后特征。
对于低风险队列，根据性别、年龄、肿瘤等级，以及ATRX、EGFR、PTEN、TP53和IDH的突变状态进行分组后，OS在高风险组中依然表现出较好的结果（图A–F）。
高低风险亚群之间的差异表达基因（DEGs）识别
在CGGA-LGG-1数据集中，作者通过计算高风险组和低风险组之间的DEGs，共识别出328个差异表达基因（图A、B）。这些结果表明上述DEGs在GO分析中富集于细胞外基质结构成分、含胶原的细胞外基质和细胞外基质组织（图C）。此外，KEGG分析显示这些基因在p53信号通路、Hippo通路和P13K-Akt信号通路中也有显著富集（图D）。有趣的是，Hippo通路在前文提及的特征基因和DEG富集分析中均显示为调节细胞生存的关键机制。接着，作者在CGGA-LGG-1数据集中，为识别关键基因，采用了WGCNA方法（软阈值功率设定为10）（图E），共聚类出16个模块（图F）。结果发现，不同模块与高风险组相关联（图G），包括黄绿色模块（相关系数=0.29，p值 < 0.001）、粉色模块（相关系数=0.28，p值 < 0.001）和灰色模块（相关系数=0.34，p值 < 0.001）。来自CGGA-LGG-1数据集的基因与145个癌基因重叠，共得到13个基因（图H）。
在临床样本中验证SOX9、RPE65、LSM2
KEGG富集分析显示，富集程度最高的三个通路包括Hippo通路、剪接体（图A）。在GO分析中，这13个基因富集程度最高的前三项为核糖体、核糖体亚基和核糖体的结构组成成分（图B）。在13个重叠基因中，有三个基因（SOX9、RPE65、LSM2）富集于Hippo通路。为了验证从生物信息学分析中获得的关键基因（SOX9、RPE65、LSM2）的可靠性，zz结合GTEx数据库中的正常皮层样本，探讨了这些关键基因在LGG样本中的异常表达情况。结果显示，这三个关键基因在肿瘤样本中均高度表达（图C）。此外，作者收集了10例LGG样本和10例正常脑组织，通过qRT-PCR和WB检测关键基因的表达水平。在qRT-PCR结果中，RPE65的mRNA水平在LGG样本中高度表达，但其他基因在不同样本中的表达没有显著差异（图D）。在Western blot结果中，RPE65和LSM2的蛋白水平在LGG样本中高度表达（图E）。
最后，作者使用IHC切片进一步检测SOX9、RPE65、LSM2的表达（图7）。显然，这三个基因在公共数据库和我们的队列中的IHC表达存在显著差异。重要的是，RPE65的蛋白和mRNA表达在不同队列的肿瘤细胞中显著上调。
体外实验
最后，RPE65被筛选为候选分子，用于进行细胞功能实验。qPCR分析表明，RPE65在三种胶质瘤细胞系中的表达显著上调（图A）。通过WB和qPCR检测sh-RPE65的敲低效率，结果显示在T98G和U87细胞中转染效率最高（图B、C）。CCK-8实验显示，敲低RPE65后，T98G和U87细胞的存活能力受到抑制（图D）。并且，转染后肿瘤细胞系的侵袭和迁移能力受到抑制（图E、F）。
研究总结：
本研究结合CRISPR-Cas9筛选数据和TCGA数据库，识别并验证了LGG中与生存相关的关键基因。作者通过基因表达和生物信息学分析，构建了一个由19个基因组成的风险评分模型，能够有效区分高低风险患者，且在多个内部和外部数据集中得到验证。分析显示，这些基因富集于Hippo信号通路，这一通路对LGG细胞的生存和增殖具有关键调控作用。通过qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学在临床样本中验证了关键基因SOX9、RPE65和LSM2的表达水平，进一步在体外实验中证实了RPE65在胶质瘤细胞中的功能性作用。Hippo信号通路和RPE65等关键基因可能成为LGG的新型治疗靶点，为精准治疗提供了潜在的策略。
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