今天分享1篇揭示玉米与根际有益微生物互作的遗传调控及环境适应性机理的文章，最近发表在NP上面。

Heritable microbiome variation is correlated with source environment in locally adapted maize varieties

=======实验设计=======

在这个研究中，选取了129份玉米材料，其中包含11个玉米种、97个地方品种、11个玉米自交系和10个玉米杂交种（附图1）。分别在对照、干旱、低磷、低氮条件下生长，分为3个地块（附图32）。

附图1 附图32

微生物数据：采集bulk soil、rhizosphere soil和root的样品进行16S和ITS测序，从而获得三个部位细菌和真菌的丰度。
基因型数据：同时获得了129个品种材料的基因型SNP数据。
表型数据：地上部分的叶面积，叶绿素含量等表型数据（附表25）。
理化参数：大约12个不同的理化参数数据（附表26）。
环境数据：156个相关的环境数据（附表15）。

附表15 附表25 附表26

========结果========

结果1：胁迫处理显著影响了微生物组成

为了探索植物基因型对于宿主-微生物互作的影响，以及它们在胁迫处理下是如何影响植物表型的。作者使用16S和ITS对于129份玉米品种的周围土、根际土和根（4个处理：对照、干旱、缺磷、缺氮）的微生物进行定量。从群落分布来看，不管是细菌还是真菌，都能被取样部位明显区分（细菌：75.6%；真菌：40.2%）（附图4）。每个部位分开来看的话，不同处理对于细菌（根际：32%；根：26%）的影响强于真菌（根际：13%；根：11%）（图1a，1b）。但是基因型对于真菌（根际：12%；根：9.8%）的影响强于细菌（根际：6.4%；根：5.8%）。
另外，和对照相比，在干旱和缺氮条件下，细菌在根际的α-多样性显著降低，缺磷则只影响了根际，不影响根的微生物多样性（附图5a）。对于真菌，则只有在缺氮条件下根的微生物多样性、缺磷条件下根际微生物多样性显著影响。
有趣的是，交叉相互作用中，处理和基因型只对根际细菌有显著的影响（图1a）。这说明在可能存在适用于特定基因型的根际细菌。

附图4 图1 附图5

结果2：一些关键的属造成了微生物群落的差异

总体来说，作者鉴定到了815个细菌的ASV、248个真菌的ASV。接下来，删除了表达样品数目≤5%以及表达相对丰度≤0.05%的ASV。那些驱动微生物群落结构和功能的类或者ASV被定义为keystone。作者通过构建微生物的共生网络来鉴定keystone。从构建的网络来看，界内的大多数互作是正的，界间的大部分是负的。这和以前的报道也是类似的，界间的相互作用更大程度上影响了整体群落组装的稳定性和适应性。

进而，作者观察到大部分界间的负调控在不同处理之间是保守的（附图7）【不知道这个图是怎么看出来的，感觉放一个负调控的venn图会更直接】。在这些互作中，作者定义keystone为：hub score >0.1（我理解的应该是node degree）。在根际中，作者在不同处理中鉴定了20个共有的keystone，比如鞘氨醇单胞菌属、Massilia属和溶杆菌属（附图8a）。在根中，鉴定到了5个Massilia属的ASV，但是只在对照和缺氮处理中conserved（附图8b）。19个链霉菌属的ASV，只在对照和干旱处理条件下。功能预测这些细菌属与尿素分解有关（Massilia）和需氧化学异养菌（链霉菌）。真菌相关属的功能主要和分解者（37%）和病原体功能相关。

附图7 附图8

结果3：胁迫处理增强了微生物的遗传力、降低了多样性

作者发现，干旱和营养缺乏显著抑制玉米生长（附图9a）。进而发现缺氮还显著降低了叶片的叶绿素含量，但在缺磷的情况下没有观察到这个结果。这些结果说明在可控的实验条件下，玉米的表型反应了不同胁迫的处理。为了评估基因型对于微生物组成的影响，作者查看了遗传矩阵和微生物距离矩阵的相关性。Mantel统计结果显示细菌群落和基因型显著相关，真菌则只有根际和微生物显著相关。
然后，作者用一种广义上的遗传力（H2）来衡量基因型对于不同微生物的影响。在不同部位的微生物中，根际的遗传力显著高于根部的微生物群落（图1c）。不同处理显著增强了根际细菌微生物群落，真菌则没有显著变化。

为了识别受基因型选择的微生物，对于H2大于1的科、属、ASV进行了关联分析。最后，发现了533和细菌显著关联的标价，以及283个和真菌显著关联的标记（附图12）。从这些标记里面，鉴定到了567个重要的基因。这些基因的GO富集结果表明，大多数与“细胞核运输”、“RNA运输”，
“细胞核的信使核糖核酸输出”，“嘌呤核糖核苷酸分解代谢过程”等功能相关。总之，这些实验结果表明宿主基因影响的细菌群落大部分在对照和胁迫处理条件下是一致的。

附图9 广义遗传力公式 图1 附图12

结果4：植物环境因子预测根际微生物群落

为了探索微生物的差异是否反映了对于环境的适应性，作者在可控的实验条件下评估了气候和土壤因素对于微生物群落的预测能力。为了降低微生物数据的复杂度，作者先用WGCNA在根中鉴定了26个module。每个module计算了和植物表型的相关系数。特别的，有6个module和地上部门生物量以及氮含量正相关（附图13）。其中一个module（darkred）显著富集Massilia属（附图13c）。然后作者还计算了每个module和环境因子：总氮、滞留磷以及年度降水量的相关性（附图14）。其中darkred模块只有在低氮处理的样品中和采集点的总氮显著相关，从而说明Massilia在缺氮土壤中的选择适应性。

附图13
附图14

然后，作者使用SEM模型来量化遗传多样性、环境因子、胁迫处理、驯化状况、生物量等因子对于这个darkred 模块的影响。低氮处理（3.4%标准化总效果），年平均气温（2.9%标准化总效应），降水量（-10.9%标准化总效应）和植物基因型（10.8%标准化总效应）与微生物组显著相关，和其中keystone Massilia属也显著相关（附图15）。

附图15

接下来作者比较了基因型、环境以及基因+环境对于ASV丰度的预测能力。结果显示，对于细菌丰度的预测准确率明显高于真菌，根际明显高于根的ASV（附图16，图2a）。有趣的是，环境加上基因型的预测准确率高于单独基因型的预测（图2a）。这和以往的结果发现，环境通过影响宿主基因来调控根际微生物的组成，是类似的。在这个实验中，生态学的建模和预测显示了环境因素在微生物群落组成上的潜在影响。因此这些局部的环境因素和基因型信息一起将在很大程度上解释和理解微生物群落如何在一个新环境中进行重组和功能重构。

附图16 图2

结果5：根际微生物提高了植物表型预测的准确率

为了探索微生物组和植物表型之间的关联，作者使用了基于环境因素的两步走策略，基于基因型的预测和随机森林模型。作者分别使用基因型预测植物表型，以及基因型加上微生物组预测植物表型（图2b）。
基因型加上根际细菌预测的准确度显著提升，提升了大概10-15%。根据foxtail millet28的公开数据，我们进行了重新分析，发现与仅仅使用基因型相比，基因型+根际微生物对于11个农艺性状预测提高了约7%（附图21）。上述结果说明在不同的环境条件下，环境因素在基因组上的影响足以调控植物以及相应的微生物表型。也预示着玉米种子原生栖息地生态环境信息可以很好地预测未来新的环境下的根系和根际微生物的组装。

图2 附图20

结果6： 环境，微生物，根系伸长等关联的基因

在结果中，作者鉴定到了4个高丰度的细菌科（相对丰度＞5%）：链霉菌科、沉香菌科，Pseudonocardiaceae和Chitinophageae（图3a），以及三个高度丰富的真菌科：Aspergillaceae、Trichocomaceae和Nectriaceae
（补充图26）。特别的，Oxalobacteraceae有最高的遗传力（图3b）。以往的研究表明，当玉米生长在缺氮的土壤时，Oxalobacteraceae科在玉米耐受过程中发挥着重要的作用。
然后作者把这些Oxalobacteraceae科的ASV和基因型进行了全基因组关联分析，分析结果发现其中最好的关联分析结果是ASV37（图4a），属于Massilia属。关联位点位于4号染色体上的Zm00001d048945基因内（图4a、4c）。SNP位点在ASV37高的样品中富集，并且这些样品和低氮处理显著相关（图4d）。从而说明Zm00001d048945的等位变异通过与Massilia的关联来适应氮缺乏的环境。
通过预测发现Zm00001d048945基因主要在根皮层中（提4e），主要编码包含TPX2结构域的WAVE-DAMPENED2蛋白，此蛋白在拟南芥中可以调控根的发育以及侧根的起始。作者发现根的密度和ASV37的丰度正相关（图4f），表明Massilia的招募可能与根的发育有关。
为了研究Zm00001d048945基因对根结构和Massilia丰度的影响，作者在这个基因区域鉴定到了转座子插入的2个突变体（分别来自自交系B73和F7）。突变体植株根部表型说明Zm00001d048945突变显著的降低了根密度（图4g，4h）。

为了确定对于Massilia的影响，作者在低氮和高氮条件下分别种质野生型和突变体材料，并测量了根系微生物。一般来说，氮元素缺乏会显著增强根系微生物群落的α-多样性（图5a）。同时，对于微生物部位的影响也会增强（图5b）。有趣的是，作者只检测到三个细菌分类群——Massilia，
Muribaculaceae和Pseudomonas——相对丰度在缺氮条件下的野生型和突变型植物之间显著差异（图5c）。但是Massilia丰度在氮源充足的土壤中，在野生型和突变型植物之间没有显著差异。综合来看，我们将这些结果证明了在缺氮条件下，Zm00001d048945在侧根发育以及Massilia的丰度中的调控作用。

图3 图4 图5

结果7： 单独使用Massilia可以调节玉米的发育

作者之前的研究结果表明，根际的分泌物-黄酮类，即芹菜素
和木犀草素，是根际Massilia调控侧根发育的中间载体。所以作者也检测了野生型和突变体材料中这2个物质的含量，发现在突变体中这2个物质显著累积（图5d）。通过之前的结果和这个结果说明，Massilia可能通过黄酮类分泌物介导侧根的发育。

进一步的，为了查看Massilia对于玉米根和茎发育影响的特异性，作者利用不同的菌：对照、ASV37、不包含ASV37的合成群落（SynCom12）、包含ASV37的合成群落（SynCom13），分别接种野生型和突变体材料。单独接种ASV37显著促进了突变体材料的侧根形成（图5e）。然而对于侧根发育良好的材料，Massilia并没有效果（图5e）。另外，单独接种Massilia也显著提高了在缺氮条件下，突变体材料中的叶绿素含量（图5f）和芽中氮元素的含量（图5g）。另外，Massilia对于生长的促进作用在不同的平行之间是比较稳定的（附图30）。单独接种Massilia对于根部表型以及生物量的回补也说明了关键微生物（keystone）在微生物育种中的价值。

图5 附图30

总的来说，这个研究通过根际微生物和宿主基因型联合分析的实验结果和预测结果揭示了玉米的遗传变异通过调控特定基因的表达来调节根际微生物（图6）。研究成果不仅为适应生态条件的作物遗传改良提供了创新思路，而且为养分高效品种培育提供了靶向基因和根际微生物。

图6