文章信息
- 题目：Transcription factor BZR2 activates chitinase Cht20.2 transcription to confer resistance to wheat stripe rust
- 期刊和时间：Plant Physiology，2021.8.9
- 作者和单位：通讯作者来自西北农林科技大学郭军团队
研究背景
- 油菜素内酯(BRs)作为固醇类植物激素，可参与多种过程，包括种子萌发、生长、组织分化、开花和衰老。BRs也是植物感受外部应激的关键调控者，包括生物和非生物胁迫。
- BAK1 是油菜素内酯受体BRI的共受体，被认为是植物先天免疫的主要调节因子之一。BRI和BAK1调节BRI1-EMS
suppressor (BES)/brassinazole-resistance (BZR)家族的活性，从而参与防御反应。 - 在分子水平上BRI和BAK1对BZR家族的调节机制尚未解析。
主要工作
- 分析了条锈病菌（Pst）侵染下小麦的转录组。确定了表达水平上调的BZR家族成员TaBZR2。
- 进行了TaBZR2敲除和过表达实验，并验证了表型。
- 在TaBZR2-OE中利用转录组测序进一步寻找下游影响的通路，聚焦于几丁质酶通路上的几丁质酶TaCht20.2。
- 电泳迁移率变化分析和荧光素酶报告基因分析证明TaBZR2能够与TaCht20.2启动子中存在的顺式元件（E-box）结合以驱动其表达。
- 发现TaBZR2转录因子激活TaCht20.2启动条锈病免疫。
研究结果
1.flg22,和Pst322诱导TaBZR2的转录
科研人员首先分析注射了Pst后小麦的转录组数据（Accession number CNSA:
CNP0001524, https://db.cngb.org/cnsa/），找到了唯一表达上调的BZR家族成员TaBZR2。下图是针对TaBZR2的侵染转录水平验证。
Figure1| 菌侵染时TaBZR2的转录水平time-course变化
注解：图A中CTR31和23是两种条锈病菌。A图整体是在两种菌侵染下的TaBZR2表达水平。图B检测了flg22和pst322作用下TaBZR2的表达。发现其表达上调很多。验证了TaBZR2的确参与小麦防御响应。
2.过表达TaBZR2小麦株系构建（TaBZR2-OE）
Figure2| 过表达株系TaBZR2-OE接种九种条锈病菌
注解：Fig2不过多解释，很容易理解。即两个过表达植株分别接种9株条锈病菌。稍微提一下右边柱形图。作者用的是菌DNA含量和小麦DNA含量的比值来显示菌的繁殖情况，从而描述植物的免疫抗性。菌的DNA含量通过fungal elongation factor 1 (PstEF1)表达水平统计，小麦用得是TaEF-1a基因。随后作者还进行了一些免疫抗性分析。抗性情况可以通过统计真菌生物量，夏孢子数量，菌丝长度，吸器数量，过氧化氢含量表现。
3.TaBZR2的沉默降低了小麦对toPst感染的抗性
TaBZR2的RNAi敲除株系进一步接种Pst验证免疫效应。
Figure3| RNA silence株系TaBZR2-Ri接种九种条锈病菌
4.TaBZR2调控下游几丁质酶TaCht20.2
作者对WT和TaBZR2-OE菌侵染后进行转录组测序和GO分析。差异表达基因(DEGs)集中在“几丁质结合”和“几丁质酶活性”方面。而其中作者着重关注了几丁质酶TaCht20.2，因为TaCht20.2酶在过表达植株中表达量增长了20倍。BZR家族转录因子所作用的顺式作用元件包括了E-box和BRRE，因此作者假设TaBZR2会结合在TaCht20.2的顺式作用元件区域。
几丁质酶是真菌侵染过程中主导的防御响应酶，育种时也越来越多地选择此类机制提高作物抗性。
Figure4| TaCht20.2及其突变体与TaBZR2结合情况
注解：图A是TaCht20.2启动子位置的基因结构。作者把构建的TaCht20.2敲除株系图谱也放在了里面。图B是电泳迁移实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）以检测TaBZR2是否结合于TaCht20.2启动子位置。只有不突变的TaCht20.2的顺式作用元件可以和TaBZR2结合，因此在电泳带上显色。competitor起到竞争剂的作用，加了之后会竞争TaCht20.2和TaBZR2的结合，因此显色变浅。图C放上了荧光素酶实验所构建的载体和对应的LUC值，最终结论和B一样，即只有不突变的TaCht20.2可以和TaBZR2结合。
5.TaCht20.2沉默突变体的抗性表性鉴定
作者为了验证TaCht20.2对抗性的作用，构建了TaCht20.2敲除株系，并且进行了抗性试验（Fig5）和几丁质酶活性测定（Fig6）。附件中还测有过氧化氢含量，发现过氧化氢积累量下降。进一步证明了TaCht20.2的作用。
Figure5| TaCht20.2沉默突变体的抗性表性鉴定
Figure6| 条锈菌侵染下四种TaBZR2突变体中几丁质酶活性
综上所述，本文是一篇相当规范的基因功能鉴定研究，甚至可以当做功能鉴定研究的模版供新手学习。全文采用了大量反向遗传学方法，以验证TaBZR2对TaCht20.2的调控，进而对小麦自身Pst抗性的影响。小麦的基因克隆与鉴定相较于其他作物要困难许多，同等工作量会更容易发到高分期刊。但是作者对于RNA-seq组学数据的挖掘有限，仅关注测序数据中最为显著的某几个基因。如果能更多的挖掘TaBZR2的下游靶标或者串联起各个测序数据中显著的通路，绘制大型调控网络，在工作量上做做文章。或者在TaBZR2与TaCht20.2的结合位点上纵向研究结合区的关键氨基酸位点，在深度上做做文章，想必能让本文再次上升一个台阶（到PC应该问题不大）。目前文章发表于Plant Physiology，基本符合整体水平。以上仅代表本人拙见，欢迎大家批评指正！
在这里简单提及一下正向遗传学和反向遗传学研究方法：
- 正向遗传学（Forward genetics）指的是通过获得某一性状的自发突变或者人工诱变突变体检验表性，从而鉴定控制表型的基因。遗传学实验中例如EMS诱变就是通过改变基因组来验证表型，属于正向遗传学。
- 反向遗传学（Reverse genetics）则是从基因入手，改变某个基因寻找表型变化，以探索基因的功能。分子生物学实验中检测转录组，蛋白组；RNAi技术，CRISPR-Cas9，过表达等等都是反向遗传学手段。可以说通常我们所接触的实验大多！大多！大多属于反向遗传学验证。
参考信息：
1.Xingxuan Bai, Gangming Zhan, Shuxin Tian, Huan Peng, Xiaoyu Cui, Md Ashraful Islam, Farhan Goher, Youzhi Ma, Zhensheng Kang, Zhao-Shi Xu, Jun Guo, Transcription factor BZR2 activates chitinase Cht20.2 transcription to confer resistance to wheat stripe rust, Plant Physiology, 187 (4), 2021,2749–2762. https://doi.org/10.1093/plphys/kiab383
2.Marcelo Lattarulo Campos, BRing on the fight! Brassinosteroid-related transcription factors modulate resistance to fungi attack in wheat, Plant Physiology, 187(4), 2021, 2350–2351. https://doi.org/10.1093/plphys/kiab459
3.Forward Genetics https://en.wikipedia.org/wiki/Forward_genetics
4.Reverse Genetics https://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_genetics
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