高通量模板制备步骤

高通量模板制备是高通量测序中的关键步骤，旨在为测序平台（如Illumina、Ion Torrent、PacBio和Oxford Nanopore等）提供适合的核酸模板。以下是高通量模板制备的一般步骤：

1. 样品准备

• 核酸提取：从生物样品中提取高质量的DNA或RNA。
• 定量和质量评估：使用紫外分光光度计、荧光染料（如Qubit）和琼脂糖凝胶电泳或Bioanalyzer评估样品的浓度和质量。

2. 样品片段化

• 机械切割：如超声波破碎仪（sonicator）或Covaris系统。
• 酶切法：使用限制性内切酶或其他专用酶进行切割。
• 化学法：利用化学试剂进行片段化。

3. 末端修复和加尾

• 末端修复：将片段化的DNA修复为平末端，去除黏性末端，填补缺口。
• 加A尾：在3'末端加上单个腺嘌呤（A）碱基，防止片段自连。

4. 接头连接

• 连接接头：将含有特定序列的接头（adapters）连接到DNA片段的两端。这些接头通常包含测序所需的引物结合位点和条形码序列。

5. 文库扩增（可选）

• PCR扩增：使用接头上的引物进行PCR扩增，以增加文库的量。需注意扩增循环数，以避免引入PCR偏好性。

6. 文库纯化

• 磁珠纯化：使用磁珠（如AMPure XP Beads）去除未连接的接头、引物二聚体和其他杂质。
• 凝胶纯化：通过琼脂糖凝胶电泳分离并回收目标片段。

7. 文库定量和质量评估

• 定量：使用Qubit、PicoGreen或其他荧光染料定量文库。
• 片段大小分布评估：使用Bioanalyzer或TapeStation评估文库片段的大小分布，确保片段大小符合预期。

8. 模板制备

根据不同的测序平台，模板制备的方法有所不同。以下是几种主要测序平台的模板制备方法：

Illumina平台：

• 桥式扩增（Bridge Amplification）：
  • 流动槽加载：将文库加载到含有寡核苷酸引物的流动槽（flow cell）上。
  • 桥式扩增：通过多轮PCR扩增，使DNA片段在流动槽表面形成簇（cluster），每个簇包含大量相同的DNA分子。

Ion Torrent平台：

• 乳胶PCR（Emulsion PCR, ePCR）：
  • 乳胶滴形成：将DNA片段与磁珠和PCR试剂混合，形成含有单个DNA模板的乳胶滴。
  • PCR扩增：在乳胶滴中进行PCR扩增，形成含有大量相同DNA分子的磁珠。

PacBio平台：

• 单分子实时测序（Single Molecule Real-Time Sequencing, SMRT）：
  • 环化（Circularization）：将DNA片段环化，形成单分子环状模板。
  • 上机测序：将环状模板加载到纳米孔中进行实时测序。

Oxford Nanopore平台：

• 直接测序（Direct Sequencing）：
  • 连接接头：将特定的接头连接到DNA片段两端。
  • 上机测序：将处理好的模板直接加载到纳米孔测序芯片进行测序。

9. 测序准备

• 模板稀释：根据测序平台的要求，将模板稀释到合适的浓度。
• 上机测序：将处理好的模板加载到测序平台进行测序。

10. 质控和数据分析

• 质控：在上机测序前进行最终的质控，确保模板的质量和浓度符合要求。
• 数据分析：测序完成后，进行数据分析，包括序列比对、变异检测和功能注释等。

高通量模板制备步骤的具体细节会因测序平台和实验需求的不同而有所变化。确保每一步的高质量操作对于获得可靠的测序数据至关重要