一、根癌农杆菌介导（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation, ATMT）丝状真菌遗传转化的原理
根癌农杆菌介导转化( ATMT) 技术广泛地应用于正向和反向遗传学，使得许多真菌的基因功能得以阐明。其基本原理是利用根癌农杆菌介导将T-DNA插入到真菌的宿主基因组中，与根癌农杆菌介导植物遗传转化相似, 农杆菌转化真菌时, 同样需要vir (virulence) 基因的活化, 即T-DNA (transferred DNA) 转移至真菌同植物一样是依赖于毒性系统的。
二、根癌农杆菌介导真菌遗传转化的特点
⑴ 转化受体可以是多种类型
ATMT转化的受体材料可以是多种类型的, 既可以用原生质体, 也可以用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体。
⑵ 转化效率高
同传统的真菌转化方法, 如PEG-CaCl2法相比, ATMT方法的转化效率有明显提高。
⑶ 单拷贝的随机插入
ATMT的非同源转化, 大部分转化子为单拷贝的T-DNA插入。
⑷ 转化子稳定
M.purpureus的ATMA转化子经过四轮孢子培养及筛选过程后, 98%的克隆仍然表现出对潮霉素的抗性。
三、根癌农杆菌介导真菌遗传转化的方法
⑴ 双元载体的构建及工程菌株的制备
将具有合适真菌启动子的筛选标记基因插入到T-DNA的左边界和右边界之间, 然后把构建好的双元载体 (binary vector) 通过冻融法等方法导入A.tumefaciens中。
⑵ 工程菌株的培养与处理
接种含双元载体的根癌农杆菌工程菌株到含有合适抗生素的MM (minimal medium) 培养液 (Casas-Flores et al., 2004) 中, 28℃, 200r/min培养1-2d。
⑶ 共培养及转化子的筛选、鉴定
将上述A.tumefaciens菌液与等体积的真菌分生孢子悬浮液混合, 把混合液涂布在铺有玻璃纸固体IM培养基上, 在适宜的温度 (通常为28℃) 下共培养2-3d后, 将玻璃纸转移至适于真菌生长的固体培养基上, 于适宜温度下 培养数天 (4-5d) , 直至出现抗性菌落。
四、影响根癌农杆菌介导真菌遗传转化的因素
⑴ 根癌农杆菌（EHA105）的转化OD值
根癌农杆菌介导的高效转化需要合适的农杆菌浓度，即需要与真菌的孢子数目保持一定的比例关系。农杆菌浓度太小则相对于单个真菌孢子而言达不到转化所需要的浓度，浓度过大则可能会抑制孢子的生长,导致转化失败或者转化效率太低。
⑵ 乙酰丁香酮(acetosyingone, As)的浓度
共培养基中As能起到诱导活化农杆菌vir基因的作用，浓度太低会导致农杆菌病毒蛋白表达量不够，难以完成转化，AS浓度过大可能会导致T-DNA插入的拷贝数目增加。
⑶ 菌体浓度对转化效率的影响
转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度都影响转化效率。较高的受体孢子浓度转化率相对较高。但其最高使用浓度有一定的界限, 当受体真菌的细胞浓度过高时则导致真菌的过量生长而不能挑出转化子, 使转化效率降低。
⑷ 选择标记
以潮霉素磷酸转移酶 (hygromycin B phosphotransferase, hph) 基因作为选择标记基因。
⑸ 共培养时间对转化效率的影响
共培养时间的长短关系到农杆菌vir基因的表达及其蛋白的活化以及T-DNA的剪切和复合物向孢子内的转移,过短的共培养时间将导致转化无法顺利完成.但是共培养时间太长,非转化子对转化子生长的竞争作用将导致转化效率降低,加大假阳性出现的概率。
⑹ 共培养温度对转化效率的影响
共培养温度也是影响转化效率的重要因素, 已有研究发现22~25℃是最适的转化温度。
转化流程图.png
Reference：
[1] 黄亚丽,潘玮,蒋细良,郭平,田云龙,李记鹏,朱昌雄.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展[J].生物技术通报,2007(03):111-114.
[2] 迟彦,周东坡,平文祥,李姗姗,朱婧.根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用[J].菌物学报,2005(04):142-149.
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