细胞常见问题分析

2019年1月29日，星期二，晴
今天qPCR做了一个超完美的结果，还有一个乱七八糟的。（10ul的qPCR体系还得摸索。）
本来下午准备做流式的，结果由于没有提前预约，还有一些鸡毛蒜皮的事，没能做成。不过预约了明天的了。
CCK8实验，昨天不同细胞梯度种板，今天加CCK8监测，初步确定了细胞浓度是6000cell/ml，孵育2h。（具体为啥还没搞清楚。）

华拓细胞常见问题分析

1.血清中可能出现的沉淀物是什么？
基于多年的实验研究，用于细胞培养的胎牛血清以及其它血清中可能会存在以下种类的沉淀物：（1）纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到 1-2mm，可以用肉眼观察到。 因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（可溶性的形成絮状纤维蛋白 的前体）在处理过程中仍然处于溶解状态，当经过最后的过滤分装后，就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。（2）磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在 37℃ 培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。（3）胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。他们也是血清中出现沉淀物的常见原因。

2.血清中的沉淀物对细胞培养有什么影响？
（1）细胞生长。我们的试验以及经验表明沉淀物不会影响细胞培养，我们的客户以及其它血清生产商也证明了这一点。
（2）过滤。如果血清中出现大量的沉淀物，血清将很难过滤。一般说来，因为在血清生产时最后已经经过 100nm 或者 40nm 的过滤处理，并且经过了严格的无菌检测，因此不推荐再过滤用于细胞培养的血清。在实验室中没有必要再过滤处理血清，在大觃模的细胞培养中往往将 血清直接加到培养基中一起过滤。
（3）污染。磷酸钙往往被误认为微生物污染而引起争端，研究者可能会在血清中观察到一些絮状的沉淀，因此就会比较警觉的去做无菌试验，将血清放在培养箱中培养几天，结果可能会观察到更多的絮状沉淀，因此就断定血清被污染了。并且当研究者将血清样品放在倒置显微镜下观察时往往可以看到一些可以运动的小黑点，因此就更加确认是血清被污染了。于是，研究者就会花费更多的时间和精力来和生产商确认，但最终确定血清没有被污染而只是沉淀。为了避免这些问题的发生，我们建议不要直接将血清放在培养箱中培养观察是否有菌，而是将血清加到琼脂板上进行培养以观察是否有细菌生长。另外，也可以进行革兰氏染色，在油镜下观察，以确认是否有污染。

3.如何避免血清中沉淀物的出现？
首先要注意正确的血清解冻步骤，而且溶解过程中一定要每隔一段时间均匀而缓慢的摇动血清。我们已经发现在下列情况下沉淀物可能增加，使用中应该尽量避免：
（1）热灭活血清；
（2）在 37℃下培养血清；
（3）反复冻融；
（4）γ射线照射；
（5）长期储存在 2-8℃；
（6）在室温下放置时间过长

4.如何去除血清中的沉淀？
如想去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装到无菌离心管中，以 400g 离心，上清液即可直接加入到培养基内一起过滤。注意：不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物，因为这可能阻塞滤膜。

5.冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入 37°C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管的爆裂。

6.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？
除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

7.一般客户拿到细胞后，应该注意什么？
客户收到细胞先不开盖，放在培养箱静置若干小时后（看细胞密度而定）在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议受收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞 100X，200X 各一张），排除细胞本身污染的情况；收到细胞未开封，出现污染状况我们负责免费发送一株细胞。 收到细胞时如无异常情况，请在显微镜下观察细胞密度，如为贴壁细胞，未超过 80%汇合度时，将培养瓶中培养液吸出，留下 10ml 培养液继续培养；超过 80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞，吸出培养液、1000 转/分钟离心 2 分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。
细胞消化液建议使用 PBS 配制，慎用 Hanks 液配制。

8.快递细胞多久能到，是寄冻存的细胞还是复苏好的细胞？
我们采用快递发货，一般外地 2--3 天，寄细胞前请确认当地温度，如果气温低于 4 度的，则采用邮寄冻存细胞。

9.如何用台盼兰计数活细胞？
用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200～2000 个/毫升，在 0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的 0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

10.细胞培养过程中，选用华拓推荐的培养体系，还需要添加其他细胞因子等培养试剂吗?
不需要。如特殊需，我公司技术人员会提前告之。

11.可否使用与原先培养条件不同的血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

12.何谓 FBS,FCS,CS,HS?
FBS(fetalbovineserum)和 FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calfserum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。

13.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

14.培养细胞时应使用 5%或 10%CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中 NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中NaHCO含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5% CO2培养细胞。

15.何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。

16.Hoechst 33258 与 Hoechst 33342 都能染核，二者区别是什么？
Hoechst 33342，也称 bisBenzimide H 33342 或 HOE 33342。分子式为 C27H28N6O •3HCl•3H2O，分子量为 615.99。Hoechst 33258，也称bisBenzimide H 33258 或 HOE 33258。分子式为 C25H24N6O•3HCl，分子量为 533.88。两种染料都是一种可以穿透细胞 膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。但是hoechst 33342 对细胞的毒性作用更小一些， 33258 穿透能力较 33342 弱，染活细胞时容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般来说 hoechst 33258 用于细胞固定后再染色，而 hoechst33342 则可以对活细胞直接进行染色。

17.附着性细胞继代时所使用的d trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用的 trypsin-EDTA 浓度为 0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应 立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 的活性降低，并 可减少污染 的机会。

18.悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可 将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞的培养液至另一新的 培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

19.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为 300xg(约 1000rpm)，5-10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。

20.细胞的接种密度为何？
依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的一重要原因。

21.细胞冷冻培养基的成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合的。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将 DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

22.DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？
冷冻保存使用的DMSO 等级，必须为 Tissueculturegrade 的 DMSO(如 SigmaD2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4°C，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。

23.冷冻保存细胞的方法？
冷冻保存方法一:冷冻管置于 4°C 30-0 分钟→(-20°C30 分钟)→-80°C16~18 小时(或隔夜)→液氮槽 vaporphase 长期储存。冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1-3°C 至–80°C 以下，再放入液氮槽 vaporphase 长期储存。-20°C 不可超过 1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

24.细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为 1x106cells/mlvial，融合瘤细胞则以 5x106cells/mlvial 为宜。

25.应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。

26.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃。

27.支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验的专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨。

28.支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数，代谢及研究的任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果的数据方有意义。

29.侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

30.CO2 培养箱的水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换。

31.为何培养基保存于 4°C 冰箱中，颜色会偏暗红色，且 pH 值会越来越偏碱性？
培养基保存于 4°C 冰箱中，培养基内的CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而 培养基中的酸碱指示剂(通常为 phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的 结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤的CO2，以调整 pH 值。

32.各种细胞培养用的 dish，flask 是否均相同？
不同厂牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部 分细胞没有太大的影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同的 dish或 flask 而有显著的生长 差异。

33.购买的细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少的情形？
研究人员在冷冻细胞的培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造 成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再 更换培养基即可。

34.购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C 太久。

35.收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

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