Somatic Mutation Profiling in Head and Neck Paragangliomas
头颈部副神经节瘤的体细胞突变分析
发表期刊：J Clin Endocrinol Metab
发表日期： 2022 Apr 23
doi:10.1210/clinem/dgac250
期刊相关信息
一、背景
副神经节瘤（PGL）和嗜铬细胞瘤（PCCs），它们一起称为PPGL（副神经节瘤和嗜铬细胞瘤），是罕见的神经内分泌肿瘤，分别由自主神经系统和肾上腺髓质节中的嗜铬细胞或肾小球细胞引起。PPGL通常以缓慢增长为特征，尽管如此，这些肿瘤依然具有转移潜力。如今，预测原发性肿瘤转移形成的可靠标志物仍然未知。
在所有人类肿瘤中，PPGLs的遗传程度最高。这些肿瘤中高达40%与种系突变有关。在不同的队列中，报告的PPGLs生殖系和体细胞突变的频率不同。由于肿瘤的罕见性，所研究的队列包括不同定位的PGLs，其中PCCs的发病率很高。此外，由于HNPGLs（头颈部副神经节瘤 ）在手术前必须进行栓塞，所以没有被纳入大多数复杂的分子遗传学研究。HNPGLs的种系和体细胞突变的频率和共同发生，以及驱动改变和肿瘤发展的分子机制仍然没有得到很好的研究。
二、材料与方法
1.数据来源
从39名HNPGLs患者身上提取了总共42个肿瘤和配对的正常组织（外周血或淋巴结）；收集的资料包括27个颈动脉PGL（CPGLs）和15个迷走神经PGL（VPGLs）的亲属甲醛固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织，12个FFPE淋巴结，以及27个血液组织
2.实验流程
(1)DNA分离、文库制备和测序
(2)生物信息学分析：处理原始读数、注释突变
(3)拷贝数变异的分析
(4)识别显著突变的基因
(5)突变特征的分析：突变特征分析是用SigProfiler进行的；根据COSMIC突变特征对提取的突变特征进行了注释，评估了COSMIC签名中每个样本的突变负担
三、实验结果
01 - 显著突变的基因
作者对42个HNPGLs和匹配的正常组织的外显子组测序数据进行了分析，并对27个CPGLs和15个VPGLs的数据进行了单独分析。总共发现了1310个体细胞非沉默变异（1059个错义，78个无义，34个拼接，29个缩进，109个帧移，和1个非停止）。有趣的是，与CPGLs相比，VPGLs发现的非沉默性突变约为其两倍（836对474个变体），表明VPGLs的PGLs的突变频率更高。然而，CPGLs和VPGLs的突变类型的百分比大致相等（图1）。
图1 HNPGLs中SMGs的变异类型和突变频率分布
使用MutSigCV，确定了6个基因，SDHD、BCAS4、SLC25A14、RBM3、TP53和ASCC1，它们在42个HNPGLs样本中的突变率高于背景突变。这些基因的特征是P≤0.01，但由于HNPGLs的突变率低且样本数量有限，所以q值不能达到P≤0.01。这组基因中有两对基因在CPGLs（SDHD和SLC25A14）和VPGLs（BCAS4和RBM3）中发生了明显突变。
在已鉴定的基因中，SDHD是一个与PPGLs相关的已知驱动基因。在所研究的队列中，SDHD的体细胞非沉默性突变频率最高（12%）（图1）。有趣的是，TP53基因的体细胞突变被证明是PPGLs中的罕见事件；然而，作者发现在HNPGLs中TP53突变频率为5%。其他基因以前没有关于这些肿瘤的报道，但却显示出令人惊讶的高频率的非沉默性体细胞突变：BCAS4（7%），SLC25A14（7%），RBM3（7%）。
02 - 胚胎和体细胞变异的情况
对所有 HNPGL 进行了 PPGL 基因组中突变的分析。该基因组由Gieldon等人提出，包括20个PPGL易感基因（EGLN1, EGLN2, MDH2, FH, SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, SDHAF2, MAX, RET,TMEM127, VHL, EPAS1, NF1, H3F3A、IDH1、IDH2、ATRX和HRAS）和64个候选基因，如著名的肿瘤相关基因，以及参与能量代谢和表观遗传调节的基因。作者在该组中包含了 4 个额外的基因：SDHAF3、SDHAF4、CSDE1 和 SLC25A11。SDHAF3和SDHAF4基因编码的蛋白质参与琥珀酸脱氢酶复合物的组装，对其正常活动很重要。CSDE1被认为是PPGLs中体细胞突变的驱动基因。在PPGLs中发现了SLC25A11基因的种系突变和杂合度丢失（LOH），并与转移的倾向有关。
在这里研究首次揭示了已鉴定突变的种系和体细胞状态。根据美国医学遗传学和基因组学学院和分子病理学协会 (ACMG-AMP) 的标准，使用 InterVar评估变异的致病性。在变异列表中，还包括那些人口频率低（<1%），被多种预测算法预测为致病的变体，但根据ACMG-AMP归类为 "不确定意义"。这些变异是可能致病的/致病性突变的潜在候选者。其中一些变体在ClinVar数据库中被描述为致病/可能致病的变体。在PPGL易感基因和候选基因中发现的种系和体细胞变异的整个清单在其他地方列出。
在57%（24/42）的HNPGLs患者中发现PPGL易感基因和候选基因的种系和体细胞变异。38%（16/42）的患者在已知PPGL相关基因中携带种系变体，即SDHB、SDHC、SDHD、NF1、FH和IDH2（图2）。在PPGL易感基因中，只有9.5%（4/42）的病例在检测到SDHD基因的体细胞变异；根据ACMG-AMP，在患者18tv（图1）中发现的一个体细胞错义变异被定义为可能是良性的，并被排除在有害变异的列表之外。值得注意的是，大多数患者都有PPGL易感基因的种系或体细胞变异。在2名患者（102tc和40tv）中，发现了2个基因中同时存在的种系变异，即SDHB/SDHC和SDHB/IDH2（图2）。4名SDHD体细胞突变的患者中，有一人（103tc）在测试的基因组中还有一个体细胞变异，即TP53。另一名患者（117tv）有一个NF1基因的种系变异。在17%（7/42）的病人中发现了新基因的体细胞变异，这些病人在所研究的任何基因中都没有携带种系或体细胞变异。体细胞突变的概况在有和没有种系突变的患者组中是不同的（图2）。
图2 在HNPGLs患者中发现的种系和体细胞变异
03 - 拷贝数变异
作者进行了BAF分析以估计PPGL相关TSG（SDHx、NF1和FH）突变的肿瘤中的CNVs，估计了肿瘤中种系杂合 SNP 和匹配的正常组织之间 VAF 值的差异。肿瘤中杂合2拷贝SNP的VAF接近0.5（考虑到测序覆盖率、误差和样本中肿瘤细胞的百分比），在匹配的正常组织中应该是一样的。VAF值接近0或1，对应于纯合SNP，可表示缺失、染色体丢失或三体。患者106tc的1号染色体短臂（p）缺失，SDHB基因的种系剪接突变c.287-2A>G（图3）。在患有SDHD种系错义变异c.A305G的所有患者（1tc2，67tc，68tc，100tc，120tc和143tc）和具有SDHD基因体细胞移码变异体的62tc患者中，都显示出11号染色体（或三体性）的潜在丢失。
图3
SDHB基因种系突变患者中染色体1p杂合性丧失
04 - 突变特征
使用SigProfilerExtractor，根据SBS-96分类法提取了2个SBS突变特征，然后将其分解为4个COSMIC参考特征：SBS1,SBS5, SBS7b, 和SBS29（图4）。在已鉴定的特征中，大多数突变与SBS5（50.2%）有关，其次是SBS29（24.8%）、SBS1（15%）和SBS7b（10%）。SBS7b和SBS29的特征被来自7个样本的突变所富集，而SBS1和SBS5分别包括来自35和40个样本的变异。平均突变负担最高的是SBS29的突变特征（每兆碱基约0.5个体细胞突变）。以前曾提出了SBS1（5-甲基胞嘧啶自发脱氨为胸腺嘧啶）、SBS7b（暴露于紫外线）和SBS29（烟草咀嚼）的病因。SBS5标志的特点是病因不明，但已发现与吸烟有关，并与个体年龄相关。
图4 SBS-96数字图谱，用于识别HNPGLs中的COSMIC突变特征
此外，作者对具有具有和不具有这些突变的种系突变的肿瘤的突变特征进行了单独分析。三种突变特征（SBS1，SBS5和SBS29）在两组中都是常见的，并且被大量的体细胞变异所富集。此外，在具有种系突变的肿瘤中发现了SBS11和SBS19 两个突变特征，在没有种系突变的病例中检测到SBS33。SBS19和SBS33的突变过程还是未知的；SBS11被认为与暴露于烷化药物有关。这些特定特征通过来自少量样本的体细胞变体所富集：SBS19的5个样本（125tv，66tc，106tc，128tc和157tc），SBS33（18tv）和SBS19（125tv）各有一个样本。
四、结论
结果表明，大多数HNPGL在PPGL相关基因中携带种系和体细胞突变，只有约五分之一的肿瘤以新基因中的体细胞变异为特征。重要的是，大多数具有TSG突变的HNPGL并不含有LOH或野生型等位基因的体细胞变异，以及染色体丢失。因此，TSG失活的第二次打击可能是由另一种遗传机制引起的。
研究还发现具有高体细胞突变率的基因中，以前只有2个基因与PPGL（SDHD和TP53）相关。另外两种SMG，SLC25A14和RBM3，被认为分别通过线粒体功能障碍/氧化应激和翻译调控/对DNA损伤的反应在HNPGL发病机制中实施。对其功能的进一步靶向研究可能开辟肿瘤发展的新机制。值得注意的是，颈动脉和迷走神经PGL的特征是一组不同的SMG。因此，尽管这些肿瘤属于同一组副交感神经PGL，但它们在有害的遗传改变方面可能有所不同。鉴定的突变特征可以理解在HNPGL中产生体细胞突变的突变过程的推定性质。此外，作者在具有种系SDHB突变的HNPGL病例中发现了烷化样特征。这一发现假设了一种新的潜在机制，该机制基于烷基化修复系统的破坏而有助于肿瘤发病机制。
结果使人们了解与HNPGL相关的体细胞变化和突变，对于鉴定参与肿瘤发展的分子机制非常重要，有助于为HNPGL患者开发个性化方法并扩大治疗选择。
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