1. in vitro transcription mRNA
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DNA片段模板需要线性化或者使用PCR产物；
mRNA结构：
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5'-Cap： 作为翻译起始的必要结构，为核糖体对mRNA的识别提供了信号；加帽确保了mRNA在蛋白质合成中进行翻译的稳定性，阻止外切核酸酶对mRNA的快速降解。修改5'端帽的化学结构进行优化，从而产生更稳定的mRNA，并提高翻译效率。
可以用帽类似物加帽，例如m7GpppG帽类似物，ARCAsm7G抗反向帽类似物等。
代表性产品：Trilink CleanCap® Reagent AG - (N-7113)，m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG
NEB：3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog
CAP GAG（3'OMe）
Yeasen 生物：Cap1-GAG m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG(100 mM)
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思考题：cap0、cap1、cap2结构的异同是什么？
Cap1-GAG is a cap analogue with the structure of m7G (5') ppp (5') (2'OMeA) pG, the molecular formula of it is C32H43N15O24P4 and the molecular weight is 1145.66. The product is used for transcription with the initial sequence of 5'AG3', and the natural cap1 structure is produced by Cap1 transcription capping. Compared with cap0 produced by traditional capping method, the cap1 structure produced by cap1 GAG enables the mRNA to have higher in vivo activity and translation efficiency.
ORF：编码区域中三个碱基为一组，称为密码子。密码子经转译成为特定的氨基酸，氨基酸串联后形成肽链，结构化后成为蛋白质。 通过DNA密码子优化可以规避可能引起过敏反应的组合以保证安全性，同时还能增强 mRNA的稳定性和翻译效率。 可以用化学修饰的替代物(如5-甲基胞嘧啶、假尿 嘧啶等)进行核苷酸替换。Moderna和BioNTech都利用了假尿嘧啶修饰对mRNA进行了优化。
Pseudo-UTP，5-核糖基尿嘧啶
代表性产品： TriLink N-1019 Pseudouridine-5'-Triphosphate
N1-Me-pUTP, 100/200mM Tris Solution
N1-Me-Pseudo UTP sodium solution GMP-grade N1-甲基假尿苷三磷酸钠盐 (100 mM)
N1-Me-pUTP, 100 200mM Tris Solution.jpg
背景信息：Pseudouridine（5-核糖基尿嘧啶）是个被发现的修饰核糖核苷。它是丰富的天然修饰RNA碱基，被认为是RNA中的“第五核苷”。它可以在结构RNA中发现，例如转移，核糖体和小核RNA。已发现假尿苷增强碱基堆积和翻译。 假尿苷-5'-三磷酸（Pseudo-UTP）用于赋予所需的mRNA特征，例如增加的核酸酶稳定性，增加的翻译或先天免疫受体与体外转录的RNA的相互作用的改变。假UTP与5-甲基胞苷-5'-三磷酸（5-甲基-CTP）一起显示出在培养和体内的先天免疫抑制，同时在近的出版物中增强了翻译。
Karikó发现tRNA结构中有假尿苷(Pseudo-UTP)不会引发免疫应答
2005年的研究发现，将假尿苷引入比例增高，RNA的免疫原性更低。
可能机制:假尿苷修饰可改善碱基配对、碱基堆叠和主链稳定性从而影响RNA结构。
而N1-Me-pUTP，多引入了一个甲基，会破坏N1提供氢键的能力，避免碱基错配的发生。
修饰性核苷酸的功能：
保证mRNA的正常表达；
降低mRNA自身的免疫原性；
提高mRNA的稳定性和翻译效率；
此外，N6-Me-A, 5-Me-C降低免疫原性
5'UTR和3'UTR：调控转译以及蛋白表达，对mRNA的转译效率、半衰期、最高表达水平等数值有影响。
Poly(A)tail：尾部长度有助于mRNA的稳定性、运输和转译效率，影响
着mRNA的半衰期。
体外转录加帽
有两种加帽方法：通过两步多酶法或共转录法。
酶法加帽
酶法加帽是较为传统的加帽方式，该方法需在T7聚合酶参与的IVT反应结束后，先纯化获得未加帽的mRNA，再通过牛痘病毒加帽酶（兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性）产生Cap0，再通过2’-O-甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化为Cap1，再次纯化获得最终的mRNA。 该过程使总体工艺步骤变得复杂、引入更多的杂质，增加了QA/QC质检项。
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牛痘加帽酶原理示意图：
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共转录法加帽
一步法共转录加帽，就是在T7聚合酶参与的IVT反应体系中直接加入帽类似物，实现一步法获得含Cap1结构的mRNA，全程只需一次纯化。 这种“一锅法”反应减少了制备步骤，进而有效缩短整体处理时间、简化纯化步骤，减少所需酶的数量。因此，化学法共转录加帽在工艺上相对简单，引入杂质少，能够迅速提升mRNA疫苗和药物的产能。目前， 一步法共转录加帽正在逐步成为了mRNA制备工艺的主流技术路线。
产品推荐：
CleanCap AG (TriLink N-7113)
mRNA was then synthesized using the HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (NEB) with the following modifications: CleanCap AG (TriLink N-7113) was added to a final concentration of 4 mM, and N1Ψ (TriLink N-1019) was fully substituted for UTP.(2022, Nature Biotech)
共转录过程中，加入帽三聚体，还可以加入假尿嘧啶，一步做到帽子修饰和内部碱基的修饰。
帽类似物分类
常用的一步法共转录体系的DNA模板序列有三种，分别为：
5’-TAATACGACTCACTATAGGG…-3’（GGG模板）
5’-TAATACGACTCACTATAAGG…-3’（AGG模板）
5’-TAATACGACTCACTATAAT…-3’（AT模板：自复制RNA）
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1. CAP GAG 以及CAP GAG（3'OMe）帽类似物
-CAP GAG是单一组分的帽类似物，结构为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG，产品用于起始序列为5'-AG…的DNA模板，通过一步法共转录加帽产生天然的Cap1结构。Pfizer–BioNTech的COVID-19 mRNA疫苗是利用CAP GAG帽类似物进行共转录加帽。
另外，CAP GAG（3'OMe）帽类似物结构为m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG，此帽类似物相对于CAP GAG来说，具有 抗反向转录作用，在有一些DNA模板或者特殊序列中表现出更好的生物学效果。
以上两种帽类似物是目前mRNA制备中最常用的加帽试剂，目前国内已经有多个mRNA疫苗公司使用该产品开发的疫苗进入到临床实验。
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2. CAP GAU帽类似物
CAP GAU结构为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU，专为 自复制RNA(saRNA)设计的，该saRNA基于正义RNA病毒，如委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、塞姆利基森林病毒(SFV)和辛德比斯病毒(SIN)的基因组，这些正义RNA病毒基因组起始是一个5'-AU…Cap1 mRNA。Ziphius公司开发的自复制mRNA疫苗—ZIP1642采用的就是CAP GAU进行共转录加帽，此款自扩增 RNA 疫苗可以在较低剂量下诱导等效或更有效的免疫反应。
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3. CAP GAG(m6A) 帽类似物
mRNA中内部碱基的修饰会影响细胞中mRNA的命运，最普遍的碱基修饰是mRNA的5'端，即与7-甲基鸟苷帽相邻的第一个编码核苷酸处。m7G帽后的第一个核苷酸是2'-O-甲基腺苷（Am），它可以在N6位被未知的核质甲基转移酶进一步甲基化，形成m6Am。
研究发现， Cap1 (m6A)帽类似物可以增加mRNA的稳定性和翻译效率。2017年的Nature文献报道了5′Cap中的m6Am控制mRNA的稳定性。2018年的Science报道了5′Cap中的m6Am在mRNA的翻译过程中有重要的作用。其主要原因可能是Cap1 (m6A)帽类似物在体内具有更高的稳定性，不容易被DCP2等脱帽。
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4. CAP GGG 以及CAP GGG（3'OMe）帽类似物
CAP GGG（3'OMe）2.jpg
帽类似物结构设计
帽类似物结构本身包含很多可修饰位点，如糖环、磷脂键、碱基取代等等，结合帽类似物特异结合蛋白eIF4E的晶体结构，可以 设计更多效果更好的新型帽类似物。当然，新型结构的帽类似物需要考虑：mRNA转录效率、加帽率、稳定性、翻译效率、免疫原性等关键因素。
帽类似物结构可修饰位点
参考资料：
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