1.callpeak
转录因子使用narrowpeak模式
mkdir ../macs3/ #创建callpeak 文件
macs3 callpeak -f BAM -t D4_CpG_STAT3_ChIP.bam -c D4_CTR_STAT3_ChIP.bam -g hs --keep-dup all -n D4_CpG_STAT3_ChIP --outdir ../macs3/ -B
macs3 callpeak -f BAM -t D4_R848_STAT3_ChIP.bam -c D4_CTR_STAT3_ChIP.bam -g hs --keep-dup all -n D4_R848_STAT3_ChIP --outdir ../macs3/ -B
查看输出结果
ls
D4_CpG_STAT3_ChIP_control_lambda.bdg D4_R848_STAT3_ChIP_control_lambda.bdg
D4_CpG_STAT3_ChIP_model.r D4_R848_STAT3_ChIP_model.r
D4_CpG_STAT3_ChIP_peaks.narrowPeak D4_R848_STAT3_ChIP_peaks.narrowPeak
D4_CpG_STAT3_ChIP_peaks.xls D4_R848_STAT3_ChIP_peaks.xls
D4_CpG_STAT3_ChIP_summits.bed D4_R848_STAT3_ChIP_summits.bed
D4_CpG_STAT3_ChIP_treat_pileup.bdg D4_R848_STAT3_ChIP_treat_pileup.bdg
#查看peak数
wc -l *.narrowPeak
1399 D4_CpG_STAT3_ChIP_peaks.narrowPeak
202 D4_R848_STAT3_ChIP_peaks.narrowPeak
1601 总用量
2.制备hg19.chrom.size文件,第3步要用：获取参考基因组chrom.sizes文件的2种方式 - 简书 (jianshu.com)
3.对macs结果文件处理及可视化
R作图
Rscript D4_CpG_STAT3_ChIP_model.r
Rscript D4_R848_STAT3_ChIP_model.r
=====================================================
对bed文件进行处理，可以传到IGV中进行查看，这里观察到的是summit位置
awk '{print $1":"$2"-"$3}' 4_CpG_STAT3_ChIP_summits.bed > 4_CpG_STAT3_ChIP_summits_IGV.bed
awk '{print $1":"$2"-"$3}' D4_R848_STAT3_ChIP_summits.bed > D4_R848_STAT3_ChIP_summits_IGV.bed
head 2_WT_rep1_summits.bed
track:name="WT_rep1-(summits)"
chr1:121352256-121352257
chr1:121353174-121353175
chr1:121353264-121353265
chr1:121353383-121353384
===================================================
将bdg文件转为bw格式，可载入IGV中进行查看
mkdir ../bw/
bedGraphToBigWig D4_CpG_STAT3_ChIP_treat_pileup.bdg ~/my_data/ref_data/hg19/hg19.chrom.sizes ../bw/D4_CpG_STAT3_ChIP_treat_pileup.bw
bedGraphToBigWig D4_R848_STAT3_ChIP_treat_pileup.bdg ~/my_data/ref_data/hg19/hg19.chrom.sizes ../bw/D4_R848_STAT3_ChIP_treat_pileup.bw
bam，bw，bed文件
362e18a058d60a8789af22b2842cef45.png
4.查看TSS附件信号强度
1.背景知识
image.png
启动子（promoter）：与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。
转录起始点（TSS）：转录时，mRNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤。
UTR（Untranslated Regions)：即非翻译区，是信使RNA（mRNA）分子两端的非编码片段。
5'-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子，3'-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。
2.下载TSS.bed文件：参考这篇教程，https://www.jianshu.com/p/d6cb795af22a
3.绘图代码
mkdir ../tss
在tss前后3kb的位置画图
computeMatrix reference-point --referencePoint TSS -S D4_R848_STAT3_ChIP_treat_pileup.bw D4_CpG_STAT3_ChIP_treat_pileup.bw -R ~/my_data/ref_data/hg19/hg19.bed -a 3000 -b 3000 --missingDataAsZero --skipZeros -o ../tss/tss.gz
plotHeatmap -m tss.gz --colorMap RdYlBu_r -out tss.png
image.png
computeMatrix reference-point函数的参数
#-b/--beforeRegionStartLength INT bp：区域前多少bp
#-a/--afterRegionStartLength INT bp：区域后多少bp
#-R/--regionsFileName File：指定bed文件
#-S/--scoreFileName File：指定bw文件
#--skipZeros：默认为False
#-o/-out/--outFileName OUTFILENAME：指定输出文件名
#--outFileSortedRegions BED file
#plotHeatmap和plotProfile函数参数
#-m/--matrixFile MATRIXFILE：指定matrix名字（computeMatrix的输出文件名）
#-o/-out/--outFileName OUTFILENAME：指定输出文件名，根据后缀自动决定图像的格式
#--plotFileFormat {"png", "eps", "pdf", "plotly"，"svg"}：指定输出文件格式
#--dpi DPI：指定dpi
#--perGroup：默认是画一个样本的所有区域群的图，使用这个选项后则按区域群画所有样本的情况
4.TSS附件信号强度结果解读
profile图（相当于Heatmap图中最上面的折线图单独展示）
9b92e4368b4f0694d808340f28a9ce78.png
Heatmap图
8be6af9fb2c22f51ed1377769d279718.png
拿一个热图做具体说明：
ac3c4f5cd2d4111f81205637df8d24b5.jpg
可以认为在距离TSS上游x处，所有基因normalization后的信号值的均值为0.060。
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