FFPE样本DNA质控

FFPE样品质控商业解决方案

市面上一些FFPE质控方案的对比

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DNA样品质控参数

尽管最佳的裂解和孵育条件可从FFPE样品中释放DNA，部分逆转甲醛修饰，但对于纯化后DNA的下游分析，仍有一些限制。首先，固定过程中的化学修饰可能引入不想要的序列变化，降低DNA稳定性和酶学分析的效率，让A260/A280的纯度分析变得困难。其次，由于FFPE样品中的DNA随时间而逐渐片段化，故只能分析短序列（例如在PCR应用中，应当设计产生短扩增子的引物）。此外，较短的DNA片段可能导致DNA产量的过高估计，因吸光值读数更高。所以对于FFPE样本需要进一步质控，才能进行后续实验及分析。

市面上有Swift 和KAPA公司使用不同长度的引物来扩增大量存在于人类基因组中的序列，根据qPCR产物比值来评估样本质量， Alu247/Alu115：Alu重复序列是哺乳动物基因组中SINE家族的一员，约有50万份拷贝。平均4～6 kb中就有一个Alu序列，是中度重复序列DNA。由于这种DNA序列中有限制性内切核酸酶AluⅠ的识别序列AGCT，所以称为Alu重复序列。通过长 (247 bp; Alu247) 、短(115 bp; Alu115) 扩增子比值可评估gDNA的完整度。

Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR扩增产物浓度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分别指129bp和41bp产物、305bp和41bp产物浓度比值。

以及Agilent公司DIN：即 DNA Integrity Number，是指DNA经安捷伦生物分析系统 2100/4200 TapeStation分析并计算的出的数值，是对DNA完整性的评分（表1）。

不同厂商DNA质控标准

质控参数间的对比

IDT科学家使用了DIN值和Q129/Q41来对不同FFPE样本DNA进行质量检测，结果显示DIN值和Q129/Q41具有很好的相关性，均能很好的衡量DNA的质量。

不同商业质控参数的一致性.PNG

FFPE样本DNA质控与测序文库关系

建库起始样本质量和投入量高，终文库的复杂度就高

DNA样本质量与文库复杂度.PNG

FFPE样本DNA质量与测序文库覆盖度间的关系

实验结果表明Q score>0.4或者DIN>3.5时，样本DNA即可对目标区域进行更有效的覆盖，此时文库丰度较好，可获得可靠的测序数据。

质控参数与测序覆盖度的关系

FFPE样本DNA投入量与测序文库丰度间的关系

同样的起始量，高质量样本的测序深度更高；同类型的样本，投入量高，测序深度也高；达到同样测序深度，高质量的样本需要的投入量更低；同样的投入量，高质量样本可达的测序深度也高。

FFPE DNA input and library complexity case

参考资料：

1. https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/application-note/dna-enrichment-from-ffpe-samples-using-xgen-lockdown-probes.pdf?sfvrsn=f7b33707_8
2. https://www.promega.com.cn/products/sequencing/quantitation-for-ngs/pronex-dna-qc-assay-abi-7500-7500fast/?catNum=NG1003#resources
3. https://www.sohu.com/a/304638891_769248