01 样本切片

石蜡样本在提取前需要进行切片处理，一般需要5-6个切片，一片镜检确定肿瘤细胞含量，其他进行后续提取处理。切片的薄厚程度对后续观察和提取会有一定影响。切片过厚不利于后续染色和组织学观察，而且组织脱蜡和蛋白酶消化困难增加；切片过薄易造成DNA的机械损伤，同时切片总面积的增加，其表面黏附的PCR抑制因子将可能增多。

为了避免FFPE样品分子分析的问题，样品染色应尽可能避免。某些染料和试剂可能对核酸造成不利影响，特别是那些用于免疫组化染色的试剂。涉及高pH和重金属离子的染色步骤应当避免。如果样品染色是必需的，则首选甲酚紫（cresyl violet），因为它与核酸分析兼容。

02 样本脱蜡

为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子和尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底的脱蜡。在此过程中，先溶解石蜡，然后去除，暴露样品，用于后续裂解缓冲液和蛋白酶K（如果合适）的处理。多种溶剂适用于脱蜡，如二甲苯、庚烷和柠檬烯等。二甲苯脱蜡不仅容易造成核酸片段化和得率低，而且对人有毒害，切片越厚或存放时间越长，脱蜡效果越差。作为溶剂法的替代，石蜡也可通过加热与FFPE样品分离：熔化后，石蜡冷却，取决于其用量，石蜡粘在管壁上，或在样品上形成一个固体层。

市面上主流试剂盒是采用无毒裂解液方法脱蜡，以及Covaris的超声乳化脱蜡，纳米级别的处理使得FFPE样品彻底脱蜡和水化。

Covaris采用高频率短波长的医用级别超声波，仪器与样本不进行接触，球型换能器产生超声聚焦作用于样本，能量利用率极高，方向和力度精准可控，处理重复性好。

covaris脱蜡效果更佳。蓝色越深代表残留的石蜡越多，中间图表示采用超声乳化可以彻底脱蜡

03 基因组DNA的纯化

由于FFPE样品包含的DNA分子会彼此交联，并与RNA和蛋白分子交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。如果可能的话，因交联而引起的化学修饰也应当逆转，因为化学修饰的DNA不能在纯化过程中高效回收，而且在PCR或其他酶学分析中是一个不佳的底物。在断裂交联和逆转化学修饰时必须小心，因剧烈的反应条件可能导致DNA的进一步片段化。

QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit提供了一个克服交联的有效方法，此试剂盒是特别为FFPE样品的基因组DNA纯化而设计的。样品先用蛋白酶K在56°C处理1小时，这一步通过消化交联蛋白而释放DNA。接着是优化缓冲液中的90°C孵育，这个部分逆转交联：在孵育过程中，氨基之间的亚甲基桥断裂，且释放出的甲醛分子与受体分子结合。

尽管过度加热会导致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在90°C孵育1小时可实现可分析基因组DNA的最佳回收。数据还显示，56°C的1小时孵育加上90°C的1小时孵育使蛋白酶K过夜孵育不再成为必需。

大鼠肝脏的FFPE切片用蛋白酶K在56°C处理1小时，之后按图中所示的条件孵育。作为对照，一个样品与蛋白酶K在56°C孵育过夜。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit纯化基因组DNA，并利用分光光度计确定DNA产量。与80°C孵育和56°C的过夜孵育相比，90°C孵育实现了DNA的更佳回收。

批注 2020-06-18 .png

大鼠肝脏的FFPE切片用蛋白酶K在56°C处理1小时，之后按图中所示的条件不同时间和温度孵育。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取基因组DNA，并用QuantiTect® SYBR Green PCR Kit和Pmp2基因特异的2对不同引物实时定量PCR。生成的扩增子为78 bp或464 bp。90°C孵育产生的CT值比80°C孵育更低：这表明更高温的90°C孵育在逆转交联上更为有效，提供了更多有用的DNA，作为对照，一个样品与蛋白酶K在56°C孵育过夜。
在2步孵育之后，DNA可利用QIAamp MinElute® 离心柱纯化：在硅胶模上分离DNA，洗涤以去除污染，之后以20-100 μl的小体积洗脱。另外，当DNA与硅胶模结合之前，也可开展样品的RNase A消化。如果DNA的下游应用对RNA污染敏感，则需要这一步。如果纯化的DNA需要通过分光光度计定量，也需要RNase A消化，因为RNA污染也会贡献吸光值读数，导致DNA产量的过高估计。

04 Evaluation of FFPE DNA extraction kits

The data show that DNA quality and yield are independent of extraction kit, suggesting that quality and yield are influenced by original fixation or state of the FFPE block.