前言：Knock In策略，是在CRISPR/Cas9的sgRNA切割位点造成了DSB，然后通过提供DNA修复模板，引入特定的突变。普遍报道ssDNA比dsDNA效果要好，合成ssODN的方法大致由以下几类：
- 如果经费充足，直接生物公司合成，长度在200左右都不是问题。
- 变性胶电泳法（试剂盒，比较贵）
- ivTRT，采用反转录发生成，具体又根据消化RNA:DNA杂交链中的RNA，又有几种操作。
- Lambda酶消化法
ivTRT
文献：Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors
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实验流程：
Step1:含T7 启动子的DNA序列扩增
Step2:由T7转录酶转录生成RNA的过程
Step3:反转录
| Reagent | volumn |
|---|---|
| ssRNA | 1000ng |
| Gene Specific RT Primer | x |
| dNTP | 1 |
| RNase free H2O | up to 10 ul |
65℃加热5min，冰上骤冷至少2min;
| Template RNA/Primer mixture | 10 ul |
|---|---|
| 5*PrimerScript II Buffer | 4 ul |
| RNase inhibitor | 0.5 ul |
| RTase | 1 ul |
| RNase free H2O | up to 20 ul |
注：对体系内的dNTP和引物量进行了梯度摸索，在dNTP含量2ul，RT引物4ul时，产物浓度最高。
Step3:消化RNA链
a)RNase H法。
核糖核酸酶 H (RNase H) 可特异性降解 RNA-DNA 杂交体中的 RNA 链。该酶不会水解单链和双链 DNA 及 RNA 中的磷酸二酯键。
b) NaOH法
The reaction was incubated 1.5 hours at 58°C, after which RNA is hydrolyzed by
the addition of 42 μL {0.5 M NaOH, 0.25 M EDTA pH 8.0} and incubated 10 min at 95°C. NaOH is quenched with 42 μL {0.5 M HCL}.
——Manuel D. Lenetti 2016
Step4:产物确认
理论上，产物的组分可能是混合了ssRNA、ssODN、RNA-DNA几种，所以必须通过相应的试剂来检测其纯度。
加入RNase A，可以确认产物是否是单链RNA；
加入NaOH，可以确认产物是否是单链或者双链RNA；
加入DNase可以确认产物是否是DNA；
Lambda消化
文献：An Optimized Preparation Method for Long ssDNA Donors to Facilitate Quick Knock-In Mouse Generation
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step1:磷酸化引物合成
合成的引物只需备注5' Phosphate即可。
step2:PCR扩增
注意，扩增引物一个含有磷酸化，一个不含磷酸化。注意区分磷酸化的扩增链是哪一个。
step3:Lambda消化
Lambda 核酸外切酶作用于双链 DNA，沿 5´→3´ 方向逐步切去 5´ 单核苷酸。最适底物是 5´ 磷酸化的双链 DNA，也能缓慢降解单链 DNA 和非磷酸化底物。该酶不能从 DNA 的切刻或缺口处起始消化。
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