实验室新服务器需要安装cellranger，发现最新版（3.1.0）与旧版（1.2.0）有点差别，故整理流程如下：

1. 下载安装

1.1下载地址

[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest](https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest)
wget -O cellranger-3.1.0.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-3.1.0.tar.gz?Expires=1564516562&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTMuMS4wLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU2NDUxNjU2Mn19fV19&Signature=LjEM6kHZLAa-5QpBoR8adaynXbxxMczkx9hYBprJqYBTeM1duSTqNQ-kTe-qvNWY18C-mrjX0cql9jETFVUHIgQzh3UILSdzScAH82dk7iCaDPcsjpwkajQpR9gQf5Es2laj5yvRDw0vgd1OsifTn5XwDxc557Bba58mTxz5TChZsh1Apf~2sgQkDqh4toBRJXXfn7EzX~VbxI1x3ZOnyAqS0D1h54T5K6mL1ez3LPIRfk7WWifNs0dT4B6qcBHZ~vTjwo6kU2A2azM0EzUdnJvutdO1BoIaq4ymEjdvug4r8AEhAjnM7knc9CeGlTp9Pd7Fl5rneafCPw5sYfqfSw__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"

1.2 安装指南

[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/installation](https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/installation)

1.2.1安装cellranger

cd biosoft/ #（文件目录）
tar -xzvf cellranger-3.1.0.tar.gz

1.2.2 添加环境变量便于调用

#临时变量
export PATH=/biosoft/cellranger-3.1.0:$PATH
#当前用户永久变量
vim ~/.bashrc
export PATH=“～/software/biosoft/cellranger-3.1.0:$PATH”

1.2.3基本命令

    cellranger mkfastq #拆分

    cellranger count #定量
    cellranger aggr #标准化，见仁见智
    cellranger reanalyze #分析
    cellranger mat2csv

    cellranger mkgtf #gtf索引
    cellranger mkref # 索引

    cellranger vdj

    cellranger mkvdjref

    cellranger testrun #测试
    cellranger upload #问题反馈
    cellranger sitecheck #系统检测

1.2.4 references

cellranger 提供了集成human+mouse的参考索引。
下载安装：

下载地址 wget http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-GRCh38-and-mm10-3.1.0.tar.gz
tar -xzvf refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0.tar.gz

自建索引：#针对3.1.0，其他物种可以参考这种方式

参考：[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/release-notes/build#grch38mm10_3.1.0](https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/release-notes/build#grch38mm10_3.1.0)
#以人为例
1.获取fasta参考基因组
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
2.获取gtf注释文件
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.gtf.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.gtf.gz
3.构建cellranger调用gtf
cellranger mkgtf Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.gtf Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.filtered.gtf \
                 --attribute=gene_biotype:protein_coding \
                 --attribute=gene_biotype:lincRNA \
                 --attribute=gene_biotype:antisense \
                 --attribute=gene_biotype:IG_LV_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_V_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_V_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_D_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_J_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_J_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_C_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_C_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_V_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_V_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_D_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_J_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_J_pseudogene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_C_gene
根据服务器配置时间长短略有不同，我这里大概一分钟。
4.构建参考索引
cellranger mkref --genome=GRCh38 \
                 --fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
                 --genes=Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.filtered.gtf \
                 --ref-version=3.1.0
这里cellranger用STAR构建ref，时长约半个小时。
也可以利用 cellranger mkref 将两个物种ref合并。3.10版本建议直接采用合并方式，以前均有单独ref方式。
具体区别还得仔细看文档。
此外，旧服务器1.2版本还有ERCC reference，3.1中已被取消。10x不建议加ERCC，Smart-seq2可以加。

1.2.5 测试

cellranger建议运行以下命令来看系统能否支持运算:
cellranger sitecheck > sitecheck.txt
cellranger upload your@email.edu sitecheck.txt
生成一个sitecheck.txt文件，记录一些系统配置的东西，如果配置不满足，官网会发信给你。

1.2.6预运行

cellranger提供预运行检查流程能否跑的通。
cellranger testrun --id=tiny
会在当前目录下生成tidy文件，cellranger3.1下生成cellranger-tiny-fastq与cellranger-tiny-ref文件。
tiny下有tiny.mri.tgz，可以作为问题诊断指南。
如果预运行失败:
cellranger upload your@email.edu tiny/tiny.mri.tgz
发邮件给官网即可。

明天更新四个pipeline使用方法。接下来计划为:
1.软件探索
2.PBMC数据集使用
3.seurat在10x上的应用
4.long ranger探索与使用