刘小泽写于19.2.19
之前得到转录本的时候，我们使用TrinityStats.pl Trinity.fasta这个命令对转录本进行了统计，结果包含了Contig Nx长度的统计，例如：
$TRINITY_HOME/util/TrinityStats.pl Trinity.fasta
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## Counts of transcripts, etc.
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Total trinity 'genes': 1388798
Total trinity transcripts: 1554055
Percent GC: 44.52
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Stats based on ALL transcript contigs:
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Contig N10: 5264
Contig N20: 3136
Contig N30: 1803
Contig N40: 989
Contig N50: 606
Median contig length: 288
Average contig: 511.61
Total assembled bases: 795066996
Contig N10: 5264表示至少10%的转录本序列拥有至少5264个碱基长度。这个结果文件中我们一般关注N50这个指标，也就是说组装结果至少一半的转录本序列的长度。
当然，基于全部contigs的统计方式有一个问题：如果转录本比较长，并且拼接得到的isoform太多，那么N50会变大【因为Nx的计算方式是：先将长度从大到小排列，然后计算总长度，依次累加contig，看哪个contig先达到总长一半，就作为N50】，但这并不能真实反映拼接情况，因此还有一个选择：每个基因选择最长的一条isoform进行统计
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## Stats based on ONLY LONGEST ISOFORM per 'GENE':
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Contig N10: 3685
Contig N20: 1718
Contig N30: 909
Contig N40: 588
Contig N50: 439
Median contig length: 281
Average contig: 433.39
Total assembled bases: 601896081
可以看到，这种方式比一开始得到的N50要小，正是降低了”一条基因有多条长的isoform“这种影响，因此如果使用N50的话，推荐使用ONLY LONGEST ISOFORM per 'GENE'这个指标中的
相比N50，还有比它更合适的ExN50 ，多了个Ex，意思就是Expressed，要看表达量
ExN50除了考虑上面N50的计算方法，还限制了必须是最高表达的转录本（代表了前x%的总表达量）
$TRINITY_HOME/util/misc/contig_ExN50_statistic.pl \
transcripts.TMM.EXPR.matrix Trinity.fasta >ExN50.stats
结果会生成这样的一个表格，第一列是Ex表达量（%），第二列是ExN50，第三列是num_transcripts
# 可以对统计结果可视化
$ TRINITY_HOME/util/misc/plot_ExN50_statistic.Rscript ExN50.stats
ExN50
之前的统计结果N50是606 bases，图中就是100这个位置（就是因为N50计算考虑的是全部的contigs），这里其实可以过滤掉一些低表达量的contigs
可以看到总体上N50统计结果是在2.4K 到3.5K，最高值再E90的位置，我们就可以使用E90N50这个统计值（大概是3.5K）作为转录本拼接质量的评价（因为拼接约完整越好，相比于之前的606 base，是不是结果好了许多？）
参考：https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Contig-Nx-and-ExN50-stats
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