7.29

作者: 寒林_4c5c | 来源:发表于2019-07-30 11:17 被阅读0次

            建库是将获得的基因序列片段化后加上特异性接头,再扩增增加其数量,以便上机进行序列检测的过程。

    一.DNA建库

    1.打断。指将DNA序列随机片段化成几百碱基乃至更小的小片段。主要采用的有超声波打断和酶剪切等。

    2.末端修复。通过特异性酶,在dNTP存在的情况下将DNA片段5'凸出末端添加碱基补平,不需要的情况下将3'凸出末端切平。紧接着,在ATP存在条件下,在DNA5'末端添加磷酸基团。

    3.接头连接。在修复后的DNA3'端添加一个A,加入内含已经合成的末端含T的接头的磁珠,通过A、T碱基互补配对加到片段末尾,作为该DNA片段的“身份证”,提出所需片段。

    4.文库扩增。通过PCR以指数形式合成大量建成的文库,以弥补前面操作导致的损失,增加单个基因的数量。

    二. RNA建库

    mRNA建库

    1.富集mRNA。用带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交,使两者结合。回收磁珠,将带有Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱(此方法对RNA完整性要求较高)。

    2.打断。采用镁离子溶液将mRNA随机打断成小片段。

    3.逆转录。逆转录合成第一链的cDNA,合成第二链时用dUTP代替dTTP,得到双链cDNA。

    4.末端修复、加A、加“Y”型接头。与DNA建库类似。

    5.PCR扩增。先用UNG酶消化掉含dUTP的DNA单链,再进行PCR。

    lncRNA(长链非编码RNA)

    1.去除rRNA。设计rRNA的探针用来吸附rRNA,再加入带链霉亲和素的磁珠来吸附这些带生物素标记的探针,从而分离出含量高的rRNA。

    2.余下步骤与mRNA基本相同。

            早期曾被人们看做天书的基因,早已被破译,在历经质量检测、文库建立后,基因序列究竟是如何被逐一读取的呢?带着这个疑问,和我们一起继续实验室之旅吧!

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