建库是将获得的基因序列片段化后加上特异性接头，再扩增增加其数量，以便上机进行序列检测的过程。
一.DNA建库
1.打断。指将DNA序列随机片段化成几百碱基乃至更小的小片段。主要采用的有超声波打断和酶剪切等。
2.末端修复。通过特异性酶，在dNTP存在的情况下将DNA片段5'凸出末端添加碱基补平，不需要的情况下将3'凸出末端切平。紧接着，在ATP存在条件下，在DNA5'末端添加磷酸基团。
3.接头连接。在修复后的DNA3'端添加一个A，加入内含已经合成的末端含T的接头的磁珠，通过A、T碱基互补配对加到片段末尾，作为该DNA片段的“身份证”，提出所需片段。
4.文库扩增。通过PCR以指数形式合成大量建成的文库，以弥补前面操作导致的损失，增加单个基因的数量。
二. RNA建库
mRNA建库
1.富集mRNA。用带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，使两者结合。回收磁珠，将带有Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱（此方法对RNA完整性要求较高）。
2.打断。采用镁离子溶液将mRNA随机打断成小片段。
3.逆转录。逆转录合成第一链的cDNA，合成第二链时用dUTP代替dTTP，得到双链cDNA。
4.末端修复、加A、加“Y”型接头。与DNA建库类似。
5.PCR扩增。先用UNG酶消化掉含dUTP的DNA单链，再进行PCR。
lncRNA(长链非编码RNA)
1.去除rRNA。设计rRNA的探针用来吸附rRNA，再加入带链霉亲和素的磁珠来吸附这些带生物素标记的探针，从而分离出含量高的rRNA。
2.余下步骤与mRNA基本相同。
早期曾被人们看做天书的基因，早已被破译，在历经质量检测、文库建立后，基因序列究竟是如何被逐一读取的呢？带着这个疑问，和我们一起继续实验室之旅吧！
网友评论