Comprehensive analysis of the immunological implication and prognostic value of CXCR4 in non-small cell lung cancer
CXCR4在非小细胞肺癌中的免疫学意义和预后价值的综合分析
发表期刊：CANCER IMMUNOL IMMUN
发表日期：2022 Oct 29
影响因子：6.630
DOI: 10.1007/s00262-022-03298-y
一、研究背景
肺癌的死亡率最高，发病率在各种癌症中排名第二，约占癌症相关死亡总数的18%。它是一种高度恶性的肿瘤。根据组织病理学类型，约85%的肺癌被归为非小细胞肺癌（NSCLC），其中肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）是最常见的亚型。
目前有48种趋化因子，属于四个亚家族；它们与七种跨膜的G蛋白偶联受体（GPCRs）相互作用，在体内不同条件下影响免疫细胞的运输。近年来，许多研究表明，趋化因子/趋化因子受体环路以自分泌和旁分泌形式相互作用，促进肿瘤细胞生存和生长，加速肿瘤新血管生成。
二、材料与方法
1、数据来源
1） 实验部分涉及中国医学科学院国家癌症中心/癌症医院（NCC/CAMS，中国北京）的NSCLC患者的回顾性研究，包括242名LUAD患者和188名LUSC患者（队列1）
2） 13名LUAD患者和33名LUSC患者（队列2）
3） CXCR4 mRNA表达谱数据和突变注释数据从癌症基因组图谱（TCGA）数据库下载
4） LUAD样本数据集（535个癌症组织和59个正常组织）和LUSC样本数据表达谱（502个癌症组织和49个正常组织）均从TCGA获得
5） 从癌症细胞系百科全书（CCLE）数据库中提取了188个肺癌细胞系的RNA-seq数据
2、分析流程
1） NSCLC中的肿瘤浸润性免疫细胞景观及其与CXCR4的相关性：CIBERSORT、TIMER
2） 评估CXCR4表达对预测免疫治疗反应的作用：从TCGA数据库中获得了经典免疫检查点的表达数据，分析了CXCR4表达与这些标志物之间的差异和关联性；加入被广泛认可的免疫反应标志物，肿瘤突变负担（TMB）、免疫分数（IPS）、新抗原和肿瘤免疫功能紊乱和排斥（TIDE）分数，以进一步评估CXCR4潜在的免疫治疗反应预测性能
3） 基因组富集分析：GSEA
4） 免疫调节剂的确定及其与CXCR4的关系从TISIDB中确定了与CXCR4显著相关的免疫刺激剂和免疫抑制剂，将这些免疫调节剂输入STRING数据库，以生成一个蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并探讨它们在NSCLC中的意义；进行了GO注释和KEGG途径富集分析
5） CXCR4相关免疫调节剂签名和nomogram的构建：识别出与LUAD和LUSC表现出明显相关性的免疫刺激因子和免疫抑制剂，并采用Cox模型中的Akaike信息准则对变量进行依次筛选；对年龄和TNM分期进行了单变量和多变量Cox回归分析，以确定NSCLC患者的独立预后因素；构建一个nomogram，为每个NSCLC患者的疾病进展提供一个预测模型
6） 免疫组化（IHC）染色和CXCR4表达的评估、RNA制备和RT-PCR
三、实验结果
01 - CXCR4与免疫细胞浸润之间的相关性
利用CIBERSORT程序计算TCGA数据库中LUAD和LUSC患者的基因表达谱得到22种免疫细胞的浸润率。LUAD和LUSC患者组织中的幼稚B细胞、浆细胞、T滤泡辅助细胞、T调节细胞、γδT细胞、M1巨噬细胞、静止树突状细胞（DC）和嗜酸性粒细胞的浸润水平明显高于正常组织。肿瘤组织中静止的CD4记忆T细胞、活化的CD4记忆T细胞、单核细胞、M2巨噬细胞、静止的肥大细胞和中性粒细胞的浸润水平都明显高于正常组织。记忆B细胞在LUAD组织中尤其明显富集，而M0巨噬细胞和活化的DC在LUSC患者中明显富集。静止的自然杀伤（NK）细胞的浸润水平在LUAD和LUSC中是对比鲜明的（图1A，B）。22种免疫细胞在LUAD和LUSC肿瘤和正常组织中的不同浸润水平以热图的形式显示出来（图1C，D）。此外，相关热图显示，22种免疫细胞在LUAD和LUSC肿瘤中表现出弱到中等程度的相关性（图1E，F）。
图1 TCGA NSCLC队列中22种肿瘤浸润性免疫细胞比例的评估
为了探索CXCR4表达协调LUAD和LUSC变化的潜在机制，确定了与CXCR4相关的突变基因。根据CXCR4表达的中位数将LUAD患者（补充图2A，C）和LUSC患者（补充图2B，D）分为高表达组和低表达组后，构建了一个热图来确定与CXCR4表达相关的突变基因的突变频率。随后，发现DNAH8、PAPPA2、SPHKAP、XIRP2和ZNF804B（补充图2E）的突变频率在LUAD队列的CXCR4高表达组和低表达组中存在明显差异。同样，CSMD2、PCDH15、RELN、SI和ZNF804A的突变频率在LUSC队列的CXCR4高表达和低表达组中也有明显不同（补充图2F）。
补充图2
为了阐明CXCR4调节不同免疫细胞浸润的内在机制，作者首先调查了主要免疫细胞与CXCR4表达之间的相关性。发现在LUAD中，CXCR4与肿瘤纯度呈中度负相关，而与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和DC细胞的肿瘤浸润呈中度正相关（补充图3A）。在LUSC中，CXCR4的表达与主要免疫细胞之间的相关性与LUAD中观察到的相似，但更为显著，特别是CXCR4与DC细胞之间的相关系数为0.624（补充图3B）。接下来，分析了CXCR4中的体细胞CNAs对免疫细胞浸润的影响。在LUAD中，CXCR4中的CNAs，包括臂级缺失和臂级增益，显著影响B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和DCs的浸润水平（补充图3c）。在LUSC中，臂级增益和高扩增显著影响B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和DCs的浸润水平（补充图3D）。此外，还评估了LUAD和LUSC中CXCR4表达和22种免疫细胞之间的相关性。
补充图3
02 - CXCR4在预测NSCLC患者免疫治疗反应中的潜在价值
为了探索CXCR4预测NSCLC患者免疫治疗反应的可能性，将PD1（PDCD1）、PDL1（CD274）、CTLA4、LAG3、GAL9（LGALS9）、TIM-3（HAVCR2）、TIGIT和PD-1LG2（PDCD1LG2）作为免疫检查点相关候选基因，评估其与CXCR4的关系。结果显示，CXCR4与LUAD中这些经典的免疫检查点的表达明显正相关，PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT和PD-1LG2的相关系数均大于0.5。此外，上述免疫检查点在CXCR4高表达组明显上调。在LUSC中，CXCR4和免疫检查点之间的差异和相关关系呈现出与LUAD相同的趋势。
近年来新开发的、被广泛认可的免疫反应标志物，包括TMB、IPS、neoantigen、TIDE评分、T细胞功能障碍评分和T细胞排斥评分也被用于综合评价。在LUAD中，没有发现高低CXCR4表达组的TMB、IPS和neoantigen水平有明显差异，但CXCR4高表达组的TIDE评分明显较低，T细胞功能障碍评分较高，T细胞排除评分较低，说明CXCR4高表达组可能对免疫治疗更敏感（补充图7A）。在LUSC中，CXCR4高表达组的TMB、IPS和T细胞功能障碍评分明显增加，而TIDE评分和T细胞排异评分明显下降，也显示了CXCR4在预测免疫治疗反应方面的潜力（补充图7B）。
补充图7
接下来，对患者（队列2）进行RT-PCR分析，以验证CXCR4表达与免疫治疗反应之间的相关性。在LUAD患者中，CXCR4的高表达与更好的免疫治疗反应基本一致。四名PR的患者中，有三人的CXCR4表达高于SD的患者（图2A，B）。百分比直方图还显示，在LUAD中，CXCR4高表达组的反应率高于低表达组，但由于样本量的限制，没有得到明显的P值（图2C）。在LUSC患者中，PR和CR患者显示出CXCR4的高表达（图2E，F）。百分比直方图显示，在LUSC中，CXCR4高表达组的反应率高于低表达组（图2G）。ROC曲线显示，CXCR4表达在LUAD免疫治疗反应队列中的AUC值为0.7778，在LUSC免疫治疗反应队列中的AUC值为0.7231，表明CXCR4表达水平具有预测免疫疗效的良好潜力（图2D，H）。此外，对队列2样本进行IHC染色，以探索CXCR4表达与免疫治疗反应的相关性。在最后的26个IHC染色样本中，分别在LUAD、LUSC和总体三组进行分析，发现CXCR4高表达组和低表达组之间的免疫治疗反应没有达到统计学意义（补充图8A-C）。然而，在26名NSCLC患者中，38%的样本在RNA和蛋白水平上有一致的CXCR4表达，这需要通过扩大样本进一步验证（补充图8D）。
图2 CXCR4可预测NSCLC中的抗PD-1免疫疗法反应
补充图8
03 - CXCR4相关的生物过程和途径
通过GSEA确定与LUAD和LUSC中CXCR4上调相关的信号通路。MYC靶点、异体移植排斥反应、DNA修复和炎症反应是LUAD中富集的前四个通路（补充图10A）。Notch信号、TGF-beta信号、顶端连接和上皮-间质转化是LUSC富集的前四个途径（补充图10B）。CCLE数据库中118个肺癌细胞系的RNA-seq数据显示，糖胺聚糖降解、长期抑制、磷脂酰肌醇信号系统和半乳糖代谢是肺癌细胞中最丰富的信号通路（补充图10C-F）。
补充图10
04 - CXCR4在NSCLC中表达的预后潜力
为了阐明CXCR4表达在LUAD和LUSC中的预后价值，对NCC队列的独立样本进行了IHC染色和生存分析，发现CXCR4的高表达与LUAD（图3A）以及LUSC患者（图3B）的预后不良明显相关。用CXCR4抗体对LUAD和LUSC肿瘤组织进行IHC染色，分别见图3C和D。
图3 基于NCC队列的NSCLC中CXCR4的生存分析
进一步，LUAD患者的单变量分析显示，OS与年龄、肿瘤长度、分化程度、T期、淋巴结转移、TNM分期和CXCR4表达显著相关。多变量分析显示，年龄、肿瘤长度、分化、淋巴结转移和CXCR4表达是LUAD的独立预后因素。在LUSC患者中，OS与肿瘤长度、分化程度、T分期、淋巴结转移和TNM分期显著相关，T分化程度、T分期和TNM分期被确定为LUSC的独立预后因素。
05 - 构建基于CXCR4相关免疫调节剂的预后特征
为了进一步阐明CXCR4的免疫特性，作者鉴定了19种免疫刺激因子和11个免疫抑制剂与LUAD以及LUSC中的CXCR4显著相关（图4A, B）。随后，在STRING数据库中构建了一个包含30个明显相关的免疫调节剂的PPI网络，包含30个节点和262条边（图4C）。GO富集分析显示，这30种免疫调节剂所涉及的生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）涵盖了淋巴细胞活化、白细胞细胞间粘附、质膜外侧、肿瘤坏死因子受体结合等调节。KEGG分析显示了免疫调节剂参与的顶级信号途径，包括肠道免疫网络的IgA产生、细胞因子-细胞因子受体的相互作用和细胞粘附分子（图4D）。
图4 识别与CXCR4有显著关系的免疫调节剂
为了探索CXCR4的预后价值，在LUAD和LUSC中构建了基于CXCR4相关免疫调节剂的预后特征。在LUAD中，对确定的免疫调节因子进行了单变量和多变量的Cox回归分析，发现HAVCR2、TGFBR1、CD40LG、CD70、CD80、KLRK1、MICB和TNFRSF17与LUAD患者的OS显著相关。随后，调整了截止值，构建了一个预后特征。根据最低标准和每种免疫调节剂的风险得分，产生了一个包含12种免疫调节剂（HAVCR2、TGFBR1、CD40、CD40LG、CD70、CD80、CXCR4、ENTPD1、KLRK1、MICB、TNFRSF14和TNFRSF17）的签名（图5A）。LUAD风险评分计算如下：
风险评分=（0.5448 * HAVCR）+（2.0341 * TGFBR1）+（0.7648 * CD40）+（0.3699 * CD40LG）+（2.9431 * CD70）+（0.6282 * CD80）+（0.6749 * CXCR4）+（0.7319 * ENTPD1）+（0.6553 * KLRK1）+（3.0730 * MICB）+（0.5057 * TNFRSF14）+（0.7327 * TNFRSF17表）。根据风险评分中值将患者分为高危组和低危组。生存分析显示，高危组的OS明显短于低危组（图5C）。高危组和低危组的风险评分和基于TNM分期的曲线下面积（AUC）分别为0.786和0.683，结合风险评分和TNM分期计算的AUC为0.816，表明该特征的预测性能良好（图5E）。同样，在LUSC中，根据CXCR4相关的免疫刺激物和免疫抑制剂构建了16种免疫调节物（ADORA2A、BTLA、CTLA4、IDO1、TGFBR1、C10orf54、CD70、HHLA2、ICOSLG、IL6、IL6R、KLRC1、KLRK1、PVR、TNFRSF13C和TNFRSF18）的预后签名（图5B）。高风险分值与LUSC患者的不良预后明显相关（图5D）。风险评分的ROC-AUC为0.809，通过结合风险评分和TNM分期计算的AUC为0.817（图5F）。
图5 基于30种CXCR4相关免疫调节剂的NSCLC预后特征的构建
图6A和B通过点状分布图和热图显示每个LUAD和LUSC患者的风险评分、OS和生存状态。单变量Cox回归模型显示，TNM病理分期、风险评分与LUAD和LUSC的OS显著相关，多变量Cox回归分析证实风险评分是LUAD的独立预后因素（图6C，D）。最后，根据LUAD和LUSC患者的风险评分构建了一个预后nomogram，它可以通过不同的变量计算出3年和5年的生存概率。
图6 评估风险评分的预后价值
四、结论
综上所述，本研究初步显示了免疫TME在NSCLC患者中的重要性，并确定了CXCR4与NSCLC免疫细胞浸润之间的相关性。作者在两个NSCLC独立队列中证明了CXCR4在预测免疫治疗反应方面强大而可靠的预后价值和性能。更重要的是，所构建的CXCR4相关免疫调节剂的预后特征被证明能准确预测LUAD和LUSC患者的生存状态，并应在临床中实施。
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