最近在看Construction of a human cell landscape at single-cell level 一文中，作者构建出了首个人类单细胞图谱，是一项十分牛的工作。重点是看到作者使用了Microwell-seq这一种scRNA-seq，因此特意了解该技术，来跟大家分享一下我对这项技术的理解。

Microwell是什么

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Microwell-seq 是浙江大学郭国冀等人 一篇Cell(doi.org/10.1016/j.cell.2018.02.001 )中提出的一种较为cost-efficient的scRNA-seq。该文公布了首个哺乳动物（小鼠）细胞图谱。

Microwell-seq的特点是使用一种特殊的琼脂糖微孔板，即Microwell作为单细胞捕获的平台。

Microwell

Microwell的制备如上图所示，其本质是由刻有约10万个小孔的硅片作为载体，再在其上包裹上PDMS和Agarose而成。从图中可以看到，单细胞加样到Microwell后会落入芯片的小孔中，一个小孔只能容纳单个细胞与一个磁珠（其protocol指出一般只有10%的小孔既有细胞又有beads）。图中有黑点的孔就是有细胞loading上的，每一个小孔相当于一个独立的反应腔，之后的细胞裂解，磁珠吸附操作都会在此完成。如此就保证了一个磁珠上的RNA只来源于一个细胞。

建库步骤

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Microwell-seq workflow

Microwell-seq 建库流程如上图所示，基本包括：

1. 分离单细胞悬液，并加上Microwell，进行单细胞捕获。通过显微镜检查细胞落入小孔的比例
2. 洗脱未加进小孔的细胞，或者一个孔中有两个细胞的doublet
3. 加入磁珠
4. 洗掉悬浮的磁珠
5. 镜检后，加入裂解液进行细胞裂解。细胞裂解后，RNA会吸附到磁珠的primer上。
6. 将磁珠转移到EP管中进行reverse transcription合成cDNA，并使用EXON I 切割。
7. 随后利用PCR扩增，构建文库。文库构建完成后便可上机测序（可使用Illumina测序仪）

Cell barcoding

Microwell-seq的barcode也是利用一种UMI的方法区分不同细胞来源的mRNA。对mRNA的富集是通过oligo(dT)实现的，所以会有3' bias

优缺点

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Microwell-seq与其他scRNA-seq技术的比较

• 优点

  1. 捕获单细胞的硅片可以反复利用，以此节约设备的成本。
  2. 细胞通量在5k以上，比FACS方法的细胞通量高。
  3. 单个文库构建成本较低，
  4. 在细胞分选的过程中加入镜检质控，提高单细胞分选质量，

• 缺点

  1. 利用oligo(dT)捕获mRNA，存在3' bias
  2. 细胞分离过程使用镜检，虽然提高了单细胞分选质量，但也增加了操作过程。

一点看法

Microwell-seq 是由华人科学家独立开发的一种单细胞测序技术，有高通量、低成本和测序质量高的特点。Microwell给我的感觉与Iontorrent的sequencing chips很相像。Iontorrent的chips是通过将beads加到一个个小孔中测序，以此辨别每个beads上的测序信号。而Microwell则是将单细胞和beads加入小孔中进行反应，本质上小孔都是提供一种独立反应腔的功能，保证各个小孔的信号不会互相干扰。这也是单细胞分离的要点，即准确地标记出RNA的细胞来源。

Iontorrent sequencing chip

以上就是我对Microwell-seq一点粗略的见解。

完。

Reference:

1. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.02.001
2. https://zhuanlan.zhihu.com/p/43482789