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工程菌表达荧光蛋白

工程菌表达荧光蛋白

作者: 谢俊飞 | 来源:发表于2024-04-19 22:53 被阅读0次

在细菌中表达荧光蛋白有两种方法,一种是导入质粒,另一种则是将荧光基因整合到染色体中。
1. 质粒转化
导入表达EGFP的质粒,更快更便捷,但是质粒在没有抗性筛选条件下容易丢失。
Efforts aimed at the introduction of plasmids from various incompatibility groups have shown that plasmids are steadily lost from transformed cells over time. Due to the difficulty in applying selective.
2. 插入染色体
根据整合到染色体所用方法不同,又有多种:
大肠杆菌Red同源重组原理
PhiC31定点插入转基因及应用案例
Tn5转座子及其应用Red/ET重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统
值得注意的是,基于Red重组和转座子的插入是随机的,因此越来越多的研究开始将目光转向CRISPR/Cas9,并且随着研究深入,也会涉及敲除、敲入、点突变等实验需求,所以CRISPR是大势所趋。

以下是基于Tn5插入EGFP的案例

应用案例1

文献:Transposase-Mediated Chromosomal Integration of Exogenous Genes in Acidithiobacillus ferrooxidans
pBAM2 plasmid元件:

hyperactive Tn5 transposase:转座酶
2个ME:镶嵌性尾端 (mosaic end /ME),
sfGFP
Amp \ Kan\tac promoter\bla terminal\

根据文献信息组合的质粒

The plasmids were electroporated into donor E. coli S17-1 λpir lacI cells for conjugation.

S17-1λpir菌株的染色体中整合了RP4-2质粒,该质粒可以携带染色体的部分DNA在接合菌株之间转移[1]。S17-1λpir菌株缺失核酸内切酶(endA1),提高了质粒DNA的产量和质量;同时为重组酶缺陷型(recA1),减少插入片段的同源重组概率,保证了插入DNA的稳定性。
S17-1λpir超级感受态细胞

应用案例2

文献:A natural symbiotic bacterium drives mosquito refractoriness to Plasmodium infection via secretion of an antimalarial lipase
文献:Driving mosquito refractoriness to Plasmodium falciparum with engineered symbiotic bacteria
Generation of GFP-tagged Serratia bacteria strains. To integrate the eGFP gene into the chromosome of Serratia strains, the transposon plasmid pBAM2-GFP was individually transformed into a donor strain E. coli S17–1λpir. The freshly cultured pBAM2-GFP-harbouring donor strain and recipient Serratia strain cells were separately washed and resuspended in 10 mM MgSO4 solution (OD600 of 0.1 for each strain), mixed (1:1) and co-cultured on LB agar plates at 37 °C for 5 h for conjugation mating.

目前研究表明,多种耐药质粒已被证实携带编码多种耐药及金属酶基因的转座子,许多包括携带转座子的质粒都属于自主转移质粒,自主转移质粒含有tra基因,该基因能够促进质粒从供体菌转移至受体菌,潜在地增加了受体菌的毒力和耐药性。在接合过程中,会形成多个接合菌毛,这些接合菌毛由tra基因编码的菌毛亚基组成,一旦接合菌毛在供、受体菌中形成了桥梁,核蛋白复合体便会激发F因子上的转移起点(oriT),F质粒编码的蛋白TraI和TraY会促进核蛋白复合体的形成,同时还有其他因素一同促进质粒的转移

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