香港大学张彤教授团队，利用宏基因组评估了污水处理厂（WWTPs）对流出物中的抗生素抗性基因（ARGs）和可移动遗传元件（MGEs），探索具有高流动性和致病性的抗性组。研究成果以“An assessment of resistome and mobilome in wastewater treatment plants through temporal and spatial metagenomic analysis”为题，于2022年在《Water Research》（IF=13.4）期刊正式发表。
研究背景
近几十年来，由超级细菌引起的顽固性传染病是人类健康威胁之一，它们通常表现出多重耐药性，并且无法用常规抗生素治疗。污水处理厂（WWTPs）被认为是传播抗生素抗性基因（ARGs）的关键点。尤其是污水处理厂排放的污水（流出物）通常会为下游集水区带来外源性ARGs和耐药菌。可移动遗传元件（MGEs）加速了ARGs跨分类边界的水平转移，包括从病原菌转移到广泛的分类群。然而，目前研究仍然缺乏对污水厂流出物中的抗性组和可移动遗传元件组的充分评估。
研究设计
1、研究对象
2018年1月至2019年2月，从香港三个当地市政污水处理厂（ST、SWH、STL）每月组织一次采样活动，对这三个污水处理厂的进水、活性污泥（AS）和最终沉淀池的出水进行采样。
2、研究方法
对采集的样本开展宏基因组测序。同时，从NCBI、MG-RAS和ENA公共数据库下载市政污水处理厂的宏基因组数据。
研究结果
1、全球污水排放量排名
三个香港污水处理厂和其他大陆国家的流出物中的ARG和MGE丰度按照相同的分析程序进行量化。这些样本总体ARG丰度存在显著差异，可分为四个等级，即1级(> 1)、2级(0.5 - 1)、3级(0.25 - 0.5) 和 4 级 (< 0.25) 。显然，香港污水处理厂出水的抗性组随时间而变化，处于2级或3级（图1）。来自新加坡和瑞士的一些污水处理厂排放等级最低（4级），而来自瑞士以及秘鲁的的其他一些污水处理厂的ARG丰度水平最高（1级）。此外，ARG 的全球平均丰度为0.5 copy/cell。
图1 ARGs的空间对比概况和流出物的暴露风险排名方案
2、绝对量化中流出物、流入物和AS的局部时间变化
应用了以每毫升 ARG 拷贝数为单位的绝对定量方法，对三个污水处理厂的ARG和MGE丰度和多样性的差异进行了13个月的比较（图2A）。
在ST中，污水中 ARGs 的总浓度随时间以随机模式变化，然而，在2018年7月之后，喹诺酮类抗性基因明显成为最丰富的ARG类型之一。对于 ST 和 STL，最丰富的 ARG 类型随着采样时间的推移而发生变化，从多药到 β-内酰胺和磺胺类耐药基因，而在 SWH 中，多药耐药基因一直是最丰富的ARG类型。研究期间没有明显的季节性变化。
本研究中使用的宏基因组学的绝对量化方法与基于qPCR方法结果相当（图2B）。与之前 qPCR 研究中的低通量相比，本研究使用1208个ARGs基因型和280个MGE参考基因的综合数据库检测到更广泛的ARGs和可移动遗传元件。
图2 ARG类型和丰富亚型的绝对量化（单位：ARGs copy/mL）
3、WWTPs显著去除了ARGs
总体而言，对于 ST、STL 和 SWH 污水处理厂，ARGs 的去除效率分别为 2.34±0.27、2.37±0.23 和 2.44±0.38。然而，对于特定的ARG类型，去除效率是完全不同的（图 3B）。在三个污水处理厂的出水样品中检测到的总共 21 种 ARG 类型中，图 3 显示了 16 种类型。在进水、AS 和流出物中存在共同的 ARG 亚型（图3A）。此外，三个污水处理厂的相同样本类型共享的核心抗性组。
图3 三个香港污水处理厂在去除ARG类型和亚型方面的表现
4、污水处理厂流出物中具有高风险的ARG变体
据报道，在环境中检测到的数百种 ARGs 会带来不同程度的健康风险，可分为五个等级（等级 I、II、III、IV 和未评估）。ST 和 STL 中 I 级 ARG 的总丰度高于全球平均丰度（图4A），表明香港污水中 ARGs 的潜在更高风险。在所有三个污水处理厂中，等级 I ARGs的平均去除效率相对低于等级 II 和等级 III（图4B）。ABE98197 是一种赋予喹诺酮类药物抗性的 qnrS 基因，是HK污水中的41个主要ARGs变体之一，引起了人名对该基因的担忧。
图4 香港三个污水处理厂高风险ARGs的丰度分布和去除效率
5、污水源头追踪以及影响 AS 抗性的因素
使用源跟踪方法来破译进水、AS 和流出物之间的关系（图5A），结果表明AS比进水更能塑造出水中的 ARG 丰度和结构。这一结果与之前的报道相似，并表明废水中的残留部分更可能由 AS 的本地细菌介导，而不是由流入物中的粪便微生物污染介导。
进一步分析直接和间接影响 AS 和流入物抗性的因素，包括抗生素浓度、细菌群落和 MGE等（图5B）。SEM分析表明，AS抗性组受细菌群落和MGE丰度的影响。
图5 对流出物ARG谱的主要贡献因素
为了方便研究交流，根据本研究中开发的抗生素暴露排名方案和污水处理厂的全球抗性组谱，构建了一个公开的共享平台（图6），可以方便科员人员进行平行比较。
图6 可公开访问的污水抗性组谱共享平台（https://smile.hku.hk/ResistanceWWTPs）
研究总结
本研究对三个香港污水处理厂和全球其他污水处理厂的抗性组和移动组进行了表征，以指导风险控制。研究从整体上观察了抗性组的丰度和多样性、它们的空间差异以及在污水处理厂整个过程中的变化，旨在检查不同WWTPs中抗性组的去除效率以及影响因素。此外，本研究应用暴露排序方法来探索具有高流动性和致病性的抗性组。
参考文献：
An assessment of resistome and mobilome in wastewater treatment plants through temporal and spatial metagenomic analysis. Water Research, 2022.
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