哺乳动物可变剪切（AS）几乎影响所有的剪切基因，脑组织AS尤其多样化，脑区域剪切因子特异性表达模式和其它RNA结合蛋白共同驱动脑区域特异性剪切，不同模式在产后发育尤其重要，RNA变化依赖彼此，他们的结合状态如何影响单个分子只能通过长读长测序评估。长读长测序单个转录本不需要组装，能够减少可变转录本组装错误并实现异构体准确定量。
本研究作者利用出生后第7天(P7)小鼠的海马(HIPP)和前额叶皮层(PFC)，基于单细胞亚型RNA测序(ScISOrSeq)鉴定脑区域可变剪切的细胞类型特异性作用。此外作者设计了一种空间异构体表达方法构建空间外显子表达图谱。该研究相关结果以“Cell-type, single-cell, and spatial signatures of brain-region specific splicing in postnatal development”为题发表在bioRxiv 上。
结果
细胞分群及差异转录本表达
基于ScISOrSeq方法分析单细胞短读长和长读长测序数据，分析细胞类型特异性剪切（图1a）。基于单细胞3’转录组数据，海马结构 24个细胞群的经典maker基因鉴定了8种胶质细胞群，6个非胶质细胞群，6非神经元细胞群（图1b）。PFC分为7个胶质细胞群，6个非胶质细胞群和7个神经细胞群，通过RNA速度确认了中间状态(图1c)。与HIPP相比，PFC中MGE和非MGE中间神经元较好地分成两个群。
比较HIPP和PFC，在395个区域DIE的基因贡献最大的两种亚型中，鉴定出76种高置信的新亚型，（图2b, 2f）。分析发现141个基因表现出差异TSS或者polyA位点的作用（图2g）。联会基因Nsmf异构体表现出差异表达（图2h-2i）。
图1
图2
脉络丛上皮细胞(CPEs)主要通过可变TSS产生不同的异构体
与外显子和polyA位点相比，TSS选择在很大程度上解释了CPE细胞的异构体调控(图3d)。此外，与非CPE转录本相比，CPE相关转录本更倾向于上游TSS。这可以实现CPE特异性的后转录修饰、翻译起始和转录因子对基因表达的控制(图3e)。
图3
发育期间相关的异构体表达差异反应了功能的动态变化
使用Slingshot处理海马体细胞亚群，分析发现从RGL到NIPCs，只有5.1%的基因表现出DIE。然而，从NIPCs到GranuleNB，再从GranuleNB到兴奋性神经元，DIE基因则是前者的三倍(图4a)。GO分析揭示了早期剪接机制本身异构体变化，然而，随着GranuleNB成熟为兴奋性神经元，DIE与突触形成和轴突延伸等相关(图4 b-d)。
图4
空间异构体测序(sliso-Seq)描绘剪接变化的空间定位
为了在空间水平验证该结论，作者基于P8矢状切片获得10X Genomics Visium空间转录组数据。与单细胞短读长HIPP数据的比对证实了兴奋性神经元在CA区域和下托的空间定位(图5a)，与PFC数据的比对证实了不同皮层的兴奋性前体(图5b)。在Pkm和Clta中确认了神经发育外显子转换，其中来自单细胞数据的非神经元和发育外显子在DG和脉络丛的空间数据中富集(图5d)。对于Snap25，单细胞数据中Snap25-a到Snap25-b的神经发育转换映射到空间外显子图谱则发生了空间位置颠倒性变化(图5e)。这支持了微环境可以决定大脑区域特定的某些基因剪接的观点。
图5
总结
该研究利用单细胞长读长测序技术，检测出生后7天小鼠大脑的特异性DIE事件，且均可以追踪到特异性的细胞类型，大多数情况下，一种细胞类型负责大脑区域特异性DIE。作者通过空间转录组和长读长测序，描绘出生后小鼠的第一个空间剪切图谱。为量化细胞类型和空间分辨率的亚型表达提供了一种强有力的方法，并揭示了大脑如何整合分子和细胞复杂性来发挥功能。
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