从今天开始小编要跟大家分享非癌症的疾病相关生信分析啦。对面感兴趣的宝宝看过来咯！！今天解说的是十月份发表在Molecular Biology Reports杂志上的一篇文章。
The integrative regulatory network of circRNA and microRNA in keloid Scarring
疤痕中circRNA和microRNA的整合调控网络
环状RNA（circRNA）是一种由环状环组成的新型非编码RNA，已被证明可作为microRNA（miRNA）的“海绵”。其作用示意图如图1所示。但是，circRNA在疤痕中的作用仍然未知。那么今天介绍的这篇文章就是关于这个的。
图1.circRNA的生物发生及其对microRNA的调控。
首先我们先整体看一下这篇文章的内容，在此研究中，作者研究了疤痕中的circRNA表达谱，以鉴定潜在的诊断和治疗性circRNA。首先作者进行了circRNA微阵列测定来确定疤痕和成对的正常皮肤组织中的circRNA表达。应用定量逆转录聚合酶链反应来评估候选circRNA的表达水平。然后作者使用显著过表达的circRNA来预测推定的miRNA靶标和miRNA与该circRNA的结合位点。最后，作者构建了一个circRNA-miRNA相互作用网络，并进行了GO和KEGG通路分析。结果显示，与正常皮肤组织相比疤痕中有52个显著上调的circRNA，24个下调的circRNA。其中显著上调的是hsa_circ_0057452，hsa_circ_0007482，hsa_circ_0057342和hsa_circ_0043688。circRNA-miRNA相互作用网络的分析表明，circRNA可以与miRNA相互作用，包括miRNA-29a，miRNA-23a-5p和miRNA-1976。
下面让我们具体来看一下这篇文章做了哪些研究吧~
材料和方法：
（1）样本来源：该研究中的疤痕患者于2014年10月至2015年5月从昆明医科大学第二附属医院招募，健康对照组的皮肤组织取自有创伤或整容手术的患者。皮肤活检组织存储在RNAlater中，直到提取RNA。样本的相关信息如表1所示：
表1.微阵列分析和PCR中纳入的受试者的临床信息
（2）RNA分离：使用RNA分离试剂盒（Ambion，Inc.，Carlsbad，CA）从疤痕和正常皮肤组织中提取总RNA。
（3）circRNA微阵列
（4）qRT‑PCR：从皮肤组织中提取总RNA，并用RNA First-Strand cDNA Synthesis Kit进行RT反应，然后使用qPCR检测试剂盒。表2列出了所使用的引物。
表2.qRT-PCR分析中使用的引物
（5）预测circRNA的miRNA结合位点：使用circBank和circBase 获得了靶向的miRNA和circRNA的相应miRNA反应元件。首先通过查询circBase数据库来识别每个circRNA。接下来，使用circBank数据库筛选相应circRNA的靶向miRNA 。最后进一步将预测的circRNA靶向的miRNA与微阵列结果整合在一起得到整合miRNA。
（6）获得整合的miRNA的靶基因：通过targetScan和miRTarBase检测到整合的miRNA的靶基因。使用Cytoscape 3.01描绘了circRNA和miRNA的相互作用网络。
（7）生物信息学分析：GO和KEGG分析。
（8）统计分析：使用SPSS进行统计分析。
结果展示：
（1）疤痕中circRNA差异表达谱：通过微阵列分析，作者在三对疤痕和正常健康皮肤组织中共检测到91,334个circRNA。然后通过P值和fold change识别了76个差异表达的circRNA，其中52个上调，24个下调（图2）。还有一个有意思的现象是在76个差异表达的circRNA中，有31个circRNA的亲本基因来自编码胶原的序列。其中9种circRNA的亲本基因来自2号染色体（图2c）。并且这些失调的circRNA多数是外显子，其次是反义circRNA（图2d）。
图2.疤痕以及正常皮肤组织中的差异表达circRNA
（2）验证选定的circRNA：为了验证微阵列数据，作者选择了14个患者的疤痕和癌旁组织与14个正常样本的5个显著差异表达的circRNA进行qRT-PCR验证。这五个circRNA的表达模式与微阵列分析的结果一致（图3）。
图3. 通过定量实时PCR验证选定的circRNA
（3）circRNA–miRNA 网络：根据qRT-PCR结果，作者选择了这五个上调的circRNA，以构建circRNA-miRNA相互作用网络。通过circBank和targetScan数据库，发现这5种circRNA可以靶向726个miRNA。其中circRNA和miRNA的互作以及结合位点如图4。
图4. circRNA–miRNA相互作用和结合位点的预测
（4）靶基因的GO和KEGG通路分析：作者使用了三个数据库（targetScan，miRanda和miRBase）来预测miRNA的靶基因，共鉴定了2138个靶基因。接下来，作者使用了DAVID和KOBAS进行了GO和KEGG分析（图5）。图中显示了其显著富集的前10个GO和KEGG通路。
图5.GO和KEGG分析
结论：该研究显示了疤痕的异常circRNA图谱。circRNA–miRNA相互作用网络以及GO和KEGG通路分析支持以下假设：circRNA失调可能在疤痕的发病和发展中起作用。然而，circRNA在疤痕中的功能仍需进一步研究。
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