大家好！单基因生信研究从最开始作为研究热点至今，仍能被不断更新思路发出好文章，其精髓在于生信数据的完美挖掘。今天给大家分享下2021年7月份发表在Frontiers in Immunology（IF=7.56）上的一篇文章。
A Pan-Cancer Analysis of CD161, a Potential New Immune Checkpoint
一种潜在的新型免疫检查点CD161在泛癌中的分析
背景介绍
基因突变的累积导致不同新生抗原在癌细胞表面表达，这是肿瘤的一个重要特征。然而，癌细胞也获得了复杂的方式来逃避免疫系统的攻击，这些方法是癌症免疫治疗成功的主要障碍。到目前为止，许多免疫逃逸机制已经被确定，包括内源性“免疫检查点”的表达，它通常缓解抗原激活后免疫反应。这些现象促进免疫检查点抑制剂作为抗癌药物的发展，包括PD1、CTLA4和LAG3的抗体。
CD161在NK、CD4+T和CD8+T细胞上表达。最近一项TILs的单细胞RNA测序研究发现，CD161在肝癌和脑胶质瘤中作为一种潜在的抑制性受体。C型凝集素结构域家族2成员D-CD161的配体，表达在恶性肿瘤细胞的细胞膜上，并形成一个免疫治疗的配体-受体通路。之前的研究已经证明CD161在肺癌中的表达与良好的临床结果相关。另一项研究证明CD8+PD-1+CD161+ T细胞亚群在肝癌中具有很强的细胞毒性作用和增殖能力。此外，在TNBC中阻断其相互作用可显著增强NK细胞介导的裂解。这些结果表明CD161在肿瘤免疫调节中发挥重要作用。然而，目前尚无报道过CD161较为全面的泛癌方面的研究。
在本研究中，我们评估了CD161的表达及其与癌症患者预后的关系。我们进一步研究了CD161与免疫细胞浸润评分、免疫检查点、免疫激活基因、免疫抑制基因、趋化因子和趋化因子受体之间的关系。我们的研究结果为CD161在泛癌中的功能作用提供了新的见解，突出了CD161影响肿瘤微环境和癌症免疫治疗的潜在机制。
材料和方法
1.数据收集：TCGA和GTEx的RNA表达和临床数据从UCSC的Xena数据库获得。DNA拷贝数和甲基化数据来自cBioPortal数据库。
2.蛋白表达分析：利用HPA数据库，研究人类肿瘤和正常组织中CD161的蛋白水平。利用String构建CD161的PPI。GeneCards观察CD161的亚细胞位置。
3.预后分析：对TCGA患者的总生存期进行Kaplan-Meier分析。通过单因素Cox回归分析，评估CD161在预测泛癌OS、DSS、DFI和PFI的意义。
4.基因集富集分析：使用TCGA数据进行CD161与所有基因的相关性分析。选择与CD161相关的基因(p<0.05)进行GSEA。
5.免疫细胞浸润分析：从ImmuCellAI、TIMER2和先前发表的研究对免疫细胞浸润评分。对于每一种TCGA肿瘤类型，将患者分为两组(CD161high和CD161low)，比较免疫细胞浸润程度。
结果
1.CD161在泛癌中的表达
我们首先评估了CD161在TCGA泛癌中的表达。结果显示，在ACC、CESC、ESCA、GBM、KIRC、KIRP、LAML、LGG、OV、PAAD、READ、SKCM、STAD和TGCT等14类肿瘤中均有CD161的高表达。而在BLCA、HNSC、LUAD和LUSC四种肿瘤中低CD161表达(图1A)。此外，在TCGA肿瘤组织中，CD161在THYM、KIRC和LUAD中表达最高(图1B)。对于GTEx中的人类正常组织，CD161在脾脏、小肠和肺中的表达最高(图1C)。
我们进一步评估了CD161在不同WHO癌症分期中的表达，发现在大多数肿瘤高分期中，包括BRCA、HNSC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、READ、SKCM和THCA(图2A-I)，CD161的表达水平较低。相反在STAD中，高分期的CD161表达增高(图2J)。
分析TCGA泛癌中配对的肿瘤和正常组织时发现，CD161在BRCA、COAD、HNSC、LIHC、LUAD、LUSC、THCA、UCEC和BLCA中低表达(图3A-I)，而在KIRC和PCPG中高表达(图3J、K)。
图1 CD161在泛癌中的表达
图2 泛癌中CD161在不同WHO分期中的表达
图3 泛癌配对样本中CD161的表达
2.CD161的预后意义
我们进一步评估了CD161在癌症患者中的预后意义。Kaplan-Meier总生存期分析结果显示，CD161是ACC、BRCA、CESC、CHOL、HNSC、LIHC、MESO、PRAD、PCPG、SARC、SKCM和THCA患者的保护因子(图4A-K)，也是UVM和LGG患者的危险因子(图4L、M)。单变量Cox回归分析显示，CD161作为ACC、BRCA、CESC、CHOL、HNSC、LIHC、LUAD、MESO、OV、SARC、SKCM、THCA和UCEC患者的保护因子，而作为ESCA、LGG、UVM的危险因子(图5A)。DSS分析显示，CD161对ACC、BRCA、CESC、CHOL、HNSC、LIHC、LUAD、READ、SARC、SKCM和THCA患者是一种保护因子，对ESCA、LGG和UVM患者是一种危险因子(图5B)。DFI分析显示，CD161对BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、LGG、LIHC和UCEC患者具有保护作用(图5C)。最后，PFI分析显示，CD161作为ACC、CESC、CHOL、HNSC、LIHC、LUAD、MESO、SKCM和UCEC患者的保护因子，也是GBM患者的危险因子(图5D)。
图4 CD161生存期分析
图5 CD161单因素Cox回归分析
3.CD161富集分析
我们用GSEA的方法评估了CD161在33种TCGA肿瘤中可能涉及到的通路。结果表明，CD161与免疫相关通路显著相关，尤其是淋巴细胞和非淋巴细胞通路之间的免疫调节相互作用，如在BRCA、HNSC、LIHC、MESO、PCPG和SKCM中(图6A-F)。这些结果表明，CD161与调节肿瘤免疫微环境以及淋巴细胞和恶性肿瘤细胞之间配体-受体相互作用密切相关。
图6 泛癌组织中CD161的GSEA
4.免疫细胞浸润分析
为了探索CD161的表达与免疫细胞浸润之间的关系，我们利用三种不同来源的免疫细胞浸润数据进行了相关性分析。TIMER2数据库结果显示，CD161与TCGA泛癌中CD8+T细胞、CD4+T细胞和Treg浸润水平呈正相关，与naïve CD4+T细胞浸润水平呈负相关(图7A-C)。采用“CIBERSOFT”方法显示CD161与Treg、CD8+T、M1样巨噬细胞浸润水平呈正相关，与M2样巨噬细胞和naïve CD4+T细胞呈负相关(图7D)。利用ImmuCellAI数据库进行相关性分析发现，CD161与CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK和Treg细胞的浸润水平呈正相关，与naive CD4+T细胞和naïve CD8+T细胞的浸润水平呈负相关(图7E)。三个数据库分析的数据是一致的。这些结果表明，CD161可能有助于增加T细胞浸润，这也解释了它在大多数肿瘤类型中的保护作用。此外，我们发现：Treg发挥抑制作用，帮助恶性肿瘤细胞逃避细胞毒性CD8+T细胞的攻击。同时Treg浸润水平也与CD161呈正相关，提示细胞毒性CD8+T细胞数量虽多，但其功能可能受限。值得注意的是，CD161表达既与M1样巨噬细胞呈正相关，也与M2样巨噬细胞呈负相关，提示CD161可能直接或间接影响巨噬细胞的极化。
图7 免疫细胞浸润分析
5.T细胞耗竭分析
肿瘤患者通常拥有大量的T细胞，但大多数都已耗竭。我们确定了CD161与耗竭T细胞标记基因、免疫激活基因、免疫抑制基因、趋化因子和趋化因子受体之间的关系。结果显示，CD161与耗竭T细胞标记基因、免疫激活基因、免疫抑制基因如TIGIT、PDCD1、LAG3、CTLA4、STING1、CD96和IDO1呈正相关(图8A、B)。此外，CD161的表达与趋化因子和趋化因子受体如CCL4和CCL5及其受体CCR4和CCR5呈正相关(图8C、D)。
图8 CD161与免疫调节相关基因的相关性
结论
在TCGA中，CD161在大多数肿瘤中存在差异表达，并被作为预测预后良好的标志物。此外，CD161的表达与淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节作用显著相关。CD161的表达与T细胞浸润、免疫检查点、免疫激活基因、免疫抑制基因、趋化因子和趋化因子受体密切相关。总之，作为新型潜在免疫检查点来说，CD161可能是肿瘤免疫治疗的靶点。
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