相分离

问题

无膜包裹的细胞器能独立的发挥自己的功能不受外界影响是如何做到的，是困扰了大家多年的问题。液-液相分离（LLPS：liquid-liquid phase separation）可能是细胞形成无膜细胞器的物理化学基础,比如细胞内的p granule, nucleolar, stress granule等。这些无膜细胞器是通过液-液相分离形成的，类似于油和水的分离。

其它

蛋白质中的内在无序区域（IDR）可以驱动相分离，并且可能对形成P颗粒等结构很重要。有趣的是，在与ALS和阿尔茨海默氏病等疾病相关的蛋白质中也发现了IDR，这些蛋白质被认为很重要。

相分离的体内体外的实验设计方法的具体指南

文章：Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates

相分离的原理

Nature reviews molecular cell biocology上的题为 Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry的文章
另外，Simon Alberti等人在2018年，发表了另一篇题为A User’s Guide for Phase Separation Assays with Purified Proteins，非常细致地阐述了体外相分离实验的纯化蛋白的考虑以及一些相关的tips。这篇Cell文章更倾向于整体实验设计指南，为相关领域的研究提出一些标准化的实验步骤，也提出了一些这个领域还需要进一步阐述的机制，以及相分离的研究的根本目的，即要研究其生物学的具体功能。

相分离的基本概念，相分离的形式，以及如何预测一个蛋白是否会形成相分离现象

LLPS的发生，高度依赖溶液中生物大分子（比如：蛋白，DNA以及RNA等）的浓度、物理化学性质，以及溶液所处的环境，比如：温度、pH、盐离子浓度、盐离子类型以及溶液中存在其它的生物大分子。
当溶液中所处的大分子浓度低于一个特定的值c时，这一体系无论在什么样的温度，pH等条件下都不能发生相分离。当高于这一浓度后，在合适的pH以及温度等条件下，就能形成相分离现象，形成相分离后，该生物大分子便有两种存在形式，一种是在溶液中的低浓度状态，一种是形成的“液滴” 中较高浓度的形式存在。随着相关条件的变化，两种形式可以相互转化。也就是说，相分离是一种高度动态的过程。

另外，LLPS不仅能形成液滴状的结构，还能继续转变为胶状物的形式。凝胶状态的相分离经常不可逆转，这也为阿尔兹海默症等体内形成的amyloid-like fibers的形成，提供了全新的思路，为相关药物的设计提供了全新的理念。已有研究表明一些蛋白的突变会加快这种LLPS向凝胶状态转化的过程。

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多数相分离根本不可能发生在一个正常的细胞中。正如仅有一小部分蛋白质能够在生理状态下发生淀粉样改变那样，仅有一小部分蛋白质的序列具有在活细胞内形成相分离的能力。截至目前为止，我们对控制相分离的基因学及生物学特性仍所知甚少。因此，在断定相分离的发生时，我们应该尤其谨慎。

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近几年涌现了许多对在生理状态下能够发生相分离的分子的普遍特征的研究。其中之一即是支架及客户蛋白的理论。支架分子被认为是相分离的驱动分子，而在相分离形成以后参与到液滴当中的则被称为是客户蛋白。支架蛋白与客户蛋白的相分离需要一个互作网络的形成，该网络常由蛋白质-蛋白质互作及蛋白质-RNA互作构成。

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蛋白质预测及其蛋白序列分析工具

体外重构相分离

相分离可以在体外通过纯化的蛋白以及核酸等在特定的条件下发生，体外重构的相分离实验对于该领域具有重要的作用。

体外的相分离现象可以非常简单的使用普通的光学显微镜观察，发生相分离的特点是溶液会从澄清变得浑浊，镜检时会看到在溶液中会存在一些如水中的油滴状态的液滴。作者建议使用PEG或者lipids包被载玻片，以更好的观察和记录相分离现象。另外，可以将蛋白或者RNA使用荧光标记，或者将不同的组分通过不同的荧光分开标记，以方便使用荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜拍摄出更好的图片，同时可以做FRAP等实验，以及持续拍摄获得LLPS动态变化过程。但是在具体应用此方法的时候要注意，一些RNA与RNA结合蛋白之间可能会被拍摄中的激光照射所交联，在拍摄的时候需要注意此类问题。

除此以外，可以使用检测溶液浑浊度的方法检测相分离，也可以使用离心沉淀的方法检测相分离现象。

需要注意的是，相关的蛋白以及RNA、DNA等各个组分的纯度是至关重要的。在此，作者提出了用于体外相分离实验的蛋白以及核酸样品的表达纯化，保存以及样品处理的标准。

在体外特定条件下，一些蛋白和RNA在足够的浓度或者合适的Buffer的情况下会发生相分离现象，通常通过在细胞内过表达这些蛋白，观察到形成较大的，球状的结构，以此来推测细胞内低浓度的该蛋白仍然会形成相分离，只是在普通的光学显微镜下无法检测到而已。然而，相分离需要足够浓度才能发生，因此，在使用过表达蛋白检测相分离的时候一定要考虑到外源过表达带来的影响。同时应该致力于寻找除过度表达之外的其他方式去证明细胞内确实发生了相分离现象。

目前被大家所接受的认为是相分离结构的的标准：形成球状结构，能够融合，同时使用FRAP技术，证明其能够发生荧光漂白恢复（图4）。但是FRAP实验并不是证明LLPS发生的金标准，仍然存在很多问题。

相分离到底意味着什么？研究相分离生物学功能

1. LLPS可以感知环境的变化，并对环境的变化做出快速响应。这种响应比通过细胞内的转录以及翻译过程更加快速。目前的一些研究已经证明，LLPS可以感知温度以及pH, 另外，还可以用于感知细胞内外源的DNA（cGAS相分离）

2. LLPS可以用来调节相关蛋白在细胞内的浓度。LLPS可以将高浓度的蛋白以液滴的形式储存起来，在细胞需要的时候将该蛋白释放到细胞环境中。

3. LLPS可以形成局部的高浓度蛋白，从而激活一些生化反应，激活相关信号转导途径以及促进细胞骨架的形成。

4. LLPS可以将一些蛋白与其底物隔离，从而抑制细胞内的一些生化反应过程。

5. LLPS可以介导一些蛋白定位到已经存在的一些无膜包裹的细胞器中。

6. LLPS的特殊结构可能对于细胞的形态起着重要作用。

7. LLPS可以介导形成一些孔状结构，比如核孔。