Resolution of Cell Fate Decisions Revealed by Single-Cell Gene Expression Analysis from Zygote to Blastocyst
利用单细胞基因表达分析揭示从受精卵到胚泡细胞命运决定的解析
作者程凉皮老师文章点评2010年汤老师与郭老师的研究（（汤富酬老师2009年的文章使得单细胞测序成为现实，郭国骥老师2010年的文章揭示对500多个细胞进行48个基因的单细胞RT-qPCR就可以进行细胞类型区分，使得单细胞测序方向转向大量细胞低深度测序）），可以应用单细胞基因表达分析去揭示发育机制，可广泛用于其他生物系统。
阅读目的
了解单细胞转录组骨灰级玩家郭国骥老师是如何在单细胞转录组学的门虚掩的时候推动单细胞转录组研究的，作者做这个研究的原因、目的以及具体设计思路与实验思路）
答：做这个研究的主要原因是除了郭老师自身的专业之外，还要结合目前植入前胚胎发育存在的现象（见概述最后一段，存在共转录因子，需要更明确的确定，于是郭老师就想找各个阶段48个关键基因转录水平的差异表达，从而为发育中的小鼠胚胎的最早细胞命运决定提供了前所未有的洞察力）
文献概要
小鼠胚泡内64细胞期存在三种不同的细胞类型。研究人员已经使用超过500个细胞的单细胞表达分析研究了直到这个阶段的细胞发育。分析的48个基因部分是基于对800多个转录因子的全胚胎分析选择的。研究人员表明，在桑椹胚中，卵裂球共表达不同种类的特异性转录因子，但是通过64细胞期，可以根据它们的定量表达谱清楚地区分三种细胞类型。我们确定Id2和Sox2分别是外细胞和内细胞的最早标记。随后是早期内细胞团中受体-配体对Fgfr 2/Fgff 4表达的反向相关性。位置和信号事件似乎先于转录程序的成熟。这些结果说明了单细胞表达分析对发育机制的洞察能力。这项技术应该广泛应用于其他生物系统。
名词背景
[if !supportLists]l [endif]64细胞期（桑葚胚64个细胞，分裂到囊胚有128细胞）
[if !supportLists]l [endif]小鼠植入前胚胎发育（内细胞团是一群偏离中心、集中在“极滋养层”下方的细胞。孵出后，囊胚附着于子宫壁上，并陷入子宫壁内，吸收母体营养并排除代谢物，这个过程称为着床或植入。）
[if !supportLists]l [endif]在着床（植入）之前，胚胎由三种不同的细胞类型组成，滋养外胚层、原始内胚层和外胚层
[if !supportLists]l [endif]TE 滋养外胚层PE 原始内胚层 EPI外胚层 ICM内细胞团
[if !supportLists]l [endif]主成分分析在高维空间中获取数据点，并定义穿过该空间的新轴(分量)，使得第一个分量捕获数据中尽可能多的方差，第二个分量(与第一个正交)捕获尽可能多的剩余方差，等等。
思考
1.500个直到这个阶段的细胞郭老师是如何取的，具体这500个细胞是处于什么阶段？作者是如何基于800多个转录因子，选出48个基因的，为什么挑选的是48个基因呢？
答：由于TFs对于确定细胞类型特异性表型至关重要，所以研究人员首先建立了一个高质量的数据集（可以用于预测细胞类型特异性），其中包含了这些调控分子的一整套植入前表达动力学。先从植入相关131，845个表达序列标签中所代表的转录因子找出2348个预测的转录因子，再与EST相关找出885个(38%)个，接着再从胚胎干细胞和滋养层干细胞文库产生的无害环境技术中鉴定的这些和额外的转录因子了802个TFs进行TaqMan实时PCR分析。
考虑到植入前发育表达谱的复杂性，我们认为有必要同时分析多个基因，以根据调控基因的表达来捕获细胞身份，而不仅仅是一个或两个。我们使用48.48动态阵列芯片(Fluidigm)，它允许在单细胞水平上平行定量分析48个基因。该分析包括人工分离单个卵裂球/细胞，随后裂解，cDNA合成，并在单个管中进行序列特异性的前倍化，并使用TaqMan real-time PCR在BioMark系统(Fluidigm)上定量基因表达。成功的关键是基因的选择。我们主要关注初始筛选中包含的转录因子，假设这些转录因子可能是细胞命运的驱动因素。其余的基因是根据囊胚内已知的差异表达选择的，或者是根据早期发育中的已知功能选择的，或者两者兼有。最后的48个基因(表S2)，包括27个转录因子，我们从129个基因中选择了它们在囊胚单细胞基因表达检测中的应用。
研究人员分析了7个发育时间点(卵母细胞、2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚、E3.5胚泡和E4.25胚泡)以及通过免疫外科分离的E4.25 ICMs的mRNA水平。（500个细胞来源）
[if !supportLists]2. [endif]囊胚的细胞数量更多，为什么不做发育到囊胚这个阶段呢？因为工作量更大吗？答：因为囊胚是决定细胞命运的决定阶段
[if !supportLists]3. [endif]位置和信号事件似乎先于转录程序的成熟。（郭老师这句话的意思是啥呢？不是转录组成熟调控的吗，而是取决于细胞所处的位置吗，内与外）
答：与位置相关，主要见图四。最初在16细胞期单细胞中等量表达，但随后逐渐与内部细胞位置相关，并最终显示出对32细胞ICM的高度特异性。此外还存在反向表达。在桑椹胚中，大多数基因的位置分配先于差异mRNA水平。
背景知识（Introduction有介绍，上述不少问题就可以回答了）
小鼠植入前发育为研究细胞命运决定的调控网络提供了一个有吸引力的模型。这个发育期从受精开始，从1细胞合子发展到胚泡。就在着床之前，胚胎由三种不同的细胞类型组成，滋养外胚层、原始内胚层和外胚层。胚胎上皮是一种功能性上皮，负责介导与子宫壁的附着和植入，随后对胎盘做出贡献，胚胎上皮是一种胚胎外细胞类型，其后代为发育中的胚胎提供模式线索和营养供应，多能上皮产生胚胎本身的所有细胞类型，是胚胎干细胞的来源。尽管从经典的发育研究中获得了许多见解，但对控制这些第一批细胞命运决定的发育遗传调控结构仍然只有初步的了解。尽管转录的合子激活在1至2细胞阶段的早期就开始了(Schultz，2002)，但细胞分化发生在胚胎压实后很晚。虽然早期的卵裂模式似乎使卵裂球偏向特定的命运(Jedrusik等人，2008年)，但胚泡的形成本质上主要是可调控的，所有16细胞卵裂球都保留了对三种胚泡细胞谱系中任何一种作出贡献的能力(Rossant和Lis，1979年；Rossant和Vijh，1980年；Suwinska等人，2008年；Ziomek等人，1982年)，桑椹胚内的位置是最终细胞命运决定的最重要贡献者(所以作者研究了桑葚胚Rossant和Tam，2009年)。
TE大约在32细胞阶段(e 3.25–e 3.5)首先形成。它来源于桑椹胚外表面细胞的成熟(Johnson和McConnell，2004)。已知Tead4是TE形成最早需要的转录因子(TF)；虽然在植入前胚胎中普遍表达，但它通过Hippo途径被功能性激活(西冈等，2008，2009；Yagi等人，2007年)。位于TEad4下游的Cdx2和Gata3是从8细胞期到胚泡共表达的两种TE特异性转录因子(Home等人，2009；Ralston等人，2010年；罗尔斯顿和罗桑特，2008年；Strumpf等人，2005年)。它们的表达最初不局限于外部细胞，但随后局限于新生的TE。虽然这两者对于胚胎移植来说都不是必需的，但是两者都驱动滋养层特异性基因的表达。
原始内胚层和外胚层由内部细胞团形成。尽管这两种谱系的形成机制尚不清楚(Rossant和Tam，2009年)，但已经表明，这些ICM细胞的命运在很大程度上是在将PE定位在ICM面向胚泡的表面之前决定的(Chazaud等人，2006年；Gerbe等人，2008年；Plusa等人，2008年)，其中最全面的基因表达分析是通过单细胞微阵列分析完成的----（注意微阵列做了这个现象）(Kurimoto等人，2006年)。
对这些ICM命运决定的分子控制最了解的是EPI。Oct4、Sox2和Nanog都是已知的对EPI的形成和/或维持至关重要的TFs，并且这些TFs中的每一个的空胚胎都是不能产生胚胎干细胞的。Oct4和Nanog空囊胚既没有EPI特征，也没有PE特征，只产生滋养层衍生物(Nichols等，1998；Silva等人，2009年)，而在Sox2空胚胎中，最初认为ICM已经建立，但是EPI细胞没有得到维持，并且至少部分与PE有关(Avilion等人，2003年)。Gata6和Gata4都是PE的早期标志(Chazaud等人，2006年；Kaji等人，2007年；Plusa等人，2008)，并且当在胚胎干细胞中过度表达时，能够驱动胚胎干细胞程序的表达(藤仓等人，2002)，但是这两种敲除都不会导致胚胎干细胞缺陷。PE缺陷表型在涉及FGF信号的敲除中很明显。Fgf4(配体)、Fgfr2(受体)和Grb2(下游效应子)空胚胎缺乏PE和/或其植入后衍生物(Arman等人，1998；Chazaud等人，2006年；费尔德曼等人，1995年)。这表明FGF信号在ICM细胞分化为PE中的重要作用，但尚不清楚这是如何建立的，因为没有证据表明这些成分在早期ICM中的差异表达（因为分化前后的FGF信号不能确定，所以没法说明FGF在ICM分化为PE中起作用）。
最近的报告描述了谱系限制的转录因子在桑椹胚内的单个卵裂球中的共表达(Dietrich和Hiiragi，2007；Plusa等人，2008年；Ralston和Rossant，2008)强调了更全面地定义表达模式的必要性。因此，研究人员试图在单细胞水平上分析一组广泛的调控因子，这些调控因子结合起来可以更好地定义胚泡发育过程中的事件。研究人员的重点是捕捉最初的转录差异，因为这些差异先于对特定细胞命运的承诺。研究人员平行分析了从1细胞受精卵到64细胞胚泡的500多个单个细胞中48个基因的mRNA水平，从而为发育中的小鼠胚胎的最早细胞命运决定提供了前所未有的洞察力。
结果
[if !supportLists]1. [endif]单细胞分析候选转录因子的鉴定
由于TFs对于确定细胞类型特异性表型至关重要，研究人员首先建立了一个高质量的数据集，其中包含了这些调控分子的一整套植入前表达动力学。研究人员首先在NCBI的UniGene数据库(Wheeler等人，2003)中鉴定了来自小鼠植入前胚胎的131，845个表达序列标签中所代表的转录因子。在小鼠基因组中编码的2348个预测的转录因子中(Panther数据库；www.pantherdb.org)，885个(38%)至少有一个植入前EST，表明了这一短暂发育时期的转录复杂性。根据从胚胎干细胞和滋养层干细胞文库产生的无害环境技术中鉴定的这些和额外的转录因子，两种细胞系来源于胚泡(Evans和Kaufman，1981；Tanaka等人，1998)，我们选择了802个TFs进行TaqMan实时PCR分析(参见在线提供的补充信息)。
我们分析了7个发育时间点(卵母细胞、2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚、E3.5胚泡和E4.25胚泡)以及通过免疫外科分离的E4.25 ICMs的mRNA水平。这些数据(表S1，保藏于www.informatics.jax.org，保藏号为J:140465)除了提供胚泡内的细胞类型特异性表达(TE对EPI/PE)之外，还提供了通过植入前发育的全面基因表达动力学。全囊胚与ICM的比较提供了胚胎移植和上皮内瘤变/上皮内瘤变表达的特异性分数，已知胚胎移植标志物被发现具有高胚胎移植特异性分数的事实证实了这一点(图S1A)。尽管这种分析不能区分ICM内的PE和EPI细胞类型，但我们能够根据来自单个ICM细胞微阵列实验的数据，将一些ICM限制性基因指定为可能的EPI或PE标记(Kurimoto等人，2006)。
有了这些时间和空间表达数据，我们就可以开始识别细胞类型形成的分子动力学，即受精卵在胚泡内转变为三种不同的细胞类型。从这些TF表达谱的复杂性可以明显看出，定义细胞类型的挑战是通过发育形成的。通过追踪在E4.25胚泡中特异性表达的多种标记，对于三种不同细胞类型中的任何一种，显然至少出现了三种不同的发育表达模式(图S1C和S1D)。以TE特异性TFs为例，Tcfap2c水平在整个胚胎植入前发育过程中保持不变，Cdx2和Gata3在8细胞-胚胎转化时上调，Gata2和Tcfap2a在桑椹胚-囊胚转化时上调。
[if !supportLists]2. [endif]单细胞基因表达分析
我们的初始数据扩展了囊胚中细胞类型特异性转录因子的已知库，并暗示了导致这种表达的复杂转录动力学。然而，这些数据是由细胞池产生的，由于细胞命运的决定是由单个细胞决定的，这种平均表达可能掩盖了有趣的单细胞动态。因此，我们接下来分析了单细胞水平的表达。考虑到植入前发育表达谱的复杂性，我们认为有必要同时分析多个基因，以根据调控基因的表达来捕获细胞身份，而不仅仅是一个或两个。我们使用48.48动态阵列芯片(Fluidigm)，它允许在单细胞水平上平行定量分析48个基因。该分析包括人工分离单个卵裂球/细胞，随后裂解，cDNA合成，并在单个管中进行序列特异性的前倍化，并使用TaqMan real-time PCR在BioMark系统(Fluidigm)上定量基因表达。成功的关键是基因的选择。我们主要关注初始筛选中包含的转录因子，假设这些转录因子可能是细胞命运的驱动因素。其余的基因是根据囊胚内已知的差异表达选择的，或者是根据早期发育中的已知功能选择的，或者两者兼有。最后的48个基因(表S2)，包括27个转录因子，我们从129个基因中选择了它们在囊胚单细胞基因表达检测中的应用。
使用这48个基因集，研究人员初步分析了从受精卵到胚泡不同发育阶段获得的总共442个单细胞(表S3)。数据的生物再现性在64细胞囊胚清晰显现，导致大多数细胞明确分配到特定的细胞类型。64细胞期胚泡的159个细胞表达谱的层次聚类明确揭示了现阶段已知存在的三种细胞类型(图1A)。95个细胞(60%)富含TE特异性标记物，如Cdx2和Krt8。40个细胞(25%)特异性富集PE标记Gata4和Pdgfra，18个细胞(11%)特异性富集EPI限制性基因，包括Nanog和Sox2。有趣地，一小组五个细胞，都来自同一个胚胎，表达了EPI和PE的一些标记，表明细胞处于过渡状态。64细胞的胚胎159个细胞中只有一个看起来确实异常，没有与三种细胞类型中的任何一种紧密对齐。
为了更好地可视化数据，我们使用了主成分分析。主成分分析在高维空间中获取数据点，并定义穿过该空间的新轴(分量)，使得第一个分量捕获数据中尽可能多的方差，第二个分量(与第一个正交)捕获尽可能多的剩余方差，等等。这里，数据点是细胞，空间是48维的(48个基因)，每个维度的坐标是细胞中给定基因的标准化基因表达值。重要的是，因为组件跨越这个48D空间，每个组件都有来自所有48个基因的贡献。应用于从64细胞胚胎，我们发现第一主成分(PC1)解释了58.6%的观察方差，而第二主成分(PC2)解释了13.5%。细胞表达模式在pc1和pc2上的投影清楚地将单个细胞分成三个不同的簇(图1B)。TE簇(例如以Cdx2表达为特征)可以沿着PC1轴与ICM细胞区分开，而两种不同类型的ICM细胞(EPI，以Nanog为特征，PE，以Gata4为特征)可以沿着PC2轴彼此区分开。注意，细胞不是根据它们在解剖胚胎中的位置来识别的，而是根据它们表达模式的关键特征来定义的。
由于PCA成分由所有48个基因组成，因此在64细胞阶段对三种细胞类型进行分类时，有可能识别出信息最丰富的基因(图1C)。虽然技术因素可能掩盖了Cdx2和Gata3特异性的程度(见补充信息)，但Id2、Dppa1、Tspan8和Krt8是TE最特异的标志物。EPI是Fgf4, Bmp4, Sox2, Nanog，和Klf2, PE, Gata4, Pdgfra，和Creb3l2。其他基因具有两种细胞类型的特征，但在第三种细胞中缺失或表达不良。例如，原型多能TF Pou5f1/ Oct4虽然在ICM中富集，但在这个阶段并不能区分EPI和PE谱系，因为它在这些细胞类型中同样表达。同样，基因如Gata6、Fgfr2和Dab2在EPI系中不表达，但在TE和PE系中均有高表达。这些表达模式反映在这些基因在PCA投影中的中间位置(图1C)
[if !supportLists]3. [endif]单个16细胞卵裂球的混合谱系表达
细胞分化被认为是在8细胞后期发生压实和极化事件后开始的(Johnson和McConnell，2004)。与这一想法一致，我们在2、4或8细胞阶段的单个细胞中没有发现明显的特征(图S2)。为了可视化随后发生的变化，我们投射了细胞的表达模式从未压缩的8细胞阶段到到32细胞阶段计算出64细胞阶段数据(图2A)。在这个发育时间框架中捕获的三个卵裂分裂中的每一个的转变有助于三种不同细胞类型向64细胞阶段PC坐标的进展。在8-至16-细胞的转变中，细胞作为一个群体，向TE谱系靠拢。到32细胞期，大多数细胞要么是TE样的，要么类似于ICM细胞类型之一，但ICM中的细胞身份尚未完全确定。到64细胞阶段，基本上所有细胞都被很好地分解成三种细胞类型之一。
如前所述，在64细胞胚胎的特征是三种细胞类型的TFs高表达。有趣的是，许多随后在胚泡中成为细胞类型受限的转录因子在大多数单个16细胞卵裂球中高水平共表达，并且表达水平与后来在谱系受限的64细胞阶段单个细胞中发现的相当。图示为TE (Cdx2，Gata3)、EPI (Nanog，Klf2)、EPI和PE (Pou5f1)以及PE (Gata6)的代表性标记(图2B)，但这也见于随后谱系受限的其他TFs，包括Esrrb、Klf4、Runx1、Snai1和Grhl2(图S4)。最近描述Nanog与Cdx2和Gata6共定位的报告与我们的数据一致(Dietrich和Hiiragi，2007；Plusa等人，2008年)。母体转录物不能解释16细胞卵裂球中的高mRNA转录物水平，因为在16细胞阶段之前转录的大量合子激活是明显的(图S4)。因此，对于这些转录因子中的许多来说，在从桑椹胚到胚泡的转变过程中，细胞类型形成时，其竞争谱系中的mRNAs被去除，而不是其各自谱系中的增加。
[if !supportLists]4. [endif]内部和外部细胞的早期差异
我们下一步的目标是确定桑椹胚向囊胚转变中最早的显著表达差异，也许是为了对相应的细胞命运决定获得一些机械性的见解。我们从进一步分析16细胞和32细胞胚胎的单细胞产生的数据开始。来自该模式的细胞被分类为干细胞，并测定了从16细胞胚胎到这些细胞类型的基因表达变化。在TFs中，Id2和Sox2因其在16-细胞至32-细胞阶段异常强的诱导作用而引人注目，Id2的诱导可能发生在新生的TE细胞中，Sox2发生在新生的ICM细胞中(图3A)。同样，这与其他许多TFs形成对比，如Nanog和Pou5f1，其水平在单细胞水平上从16细胞卵裂球到32细胞ICM几乎保持不变(尽管很高)。接下来，研究人员在16细胞桑椹胚的不同细胞中寻找Id2和Sox2更早上调的证据，第一阶段有内外细胞。虽然我们在这个阶段没有解析TE和ICM细胞类型，但是沿着PC1轴有一些细胞分散，提示一些差异表达(图2A)。根据PC1评分对16个细胞阶段的细胞进行排序显示出Id2/Sox2的反向相关性，在PC1轴的ICM端的细胞中Sox2最高，在TE端的细胞中Id2最高(图3B)。相比之下，在桑椹胚细胞群体中，TE特异性标记Cdx2和Gata3的变异似乎不如Id2显著。
为了解决这些基因表达差异是不同细胞群体之间差异的结果，还是仅仅是随机噪音的结果，我们用小提琴图分析了我们的数据(图3C)。在这些密度图中，群体噪声和基因表达噪声应在参考水平附近呈现单峰分布，而多峰分布表明了细胞群体之间明显的基因表达差异。正如所预期的，内源性对照Actb表达水平的分布是单峰的，非常窄的峰表明单个细胞之间的低差异。尽管大多数基因在16细胞阶段保持这种单峰分布，但Sox2和Id2都清楚地显示了这一点双峰分布。因此，结合Id2/Sox2的反向相关性，在桑椹胚中似乎存在Id2高/Sox2低-和Id2低/Sox 2高-表达细胞的不同群体
为了确定id2 high/sox2low和id2 low/sox2high细胞群是否与桑椹胚内的位置相关，我们接下来在解离和单细胞表达分析之前用普通细胞膜标记荧光染料(PKH26)标记完整胚胎（标记位置这一招厉害了，探究位置是否也类似空间呢）。这允许基于增加的荧光对外部细胞进行特定标记。此外，我们旨在捕获从16细胞阶段过渡到32细胞阶段的胚胎，并在此时间范围内收获胚胎。用48基因组分析从16细胞、24细胞、32细胞胚胎总共收获的132个细胞，并分类为高荧光(外细胞)或低荧光(内细胞)，排除中间荧光细胞。该分析不仅证实了确实反向的Id2/Sox2表达是最早可识别的表达差异，而且表明Id2low/Sox2high细胞代表桑椹胚的内部细胞(图4A；主成分预测见图S3)。值得注意的是，ICM标记物如Nanog、Esrrb和Klf2最初在16细胞期单细胞中等量表达，但随后逐渐与内部细胞位置相关，并最终显示出对32细胞ICM的高度特异性(图4A)。这一结果表明，在桑椹胚中，大多数基因的位置分配先于差异mRNA水平。
为了提供内部细胞特异性上调Sox2表达的独立确认，我们接下来分析了含有靶向Sox2位点的EGFP报告子的小鼠(Ellis等人，2004)。为了避免与卵母细胞驱动的EGFP分析混淆，由于在卵母细胞中检测到Sox2转录物和蛋白质，我们通过将杂合雄性与野生型雌鼠交配来追踪父系EGFP等位基因的表达（报告基因小鼠与避免混合示踪）。因此，产生的胚胎要么是野生型的，要么是杂合的，其中EGFP表达来自父系等位基因。在8细胞阶段，没有胚胎表达EGFP。EGFP表达首先在大约50%的胚胎(预期部分)中在晚期桑椹胚的内细胞中被检测到，并且这种表达随后被限制在早期胚泡的ICMs中(图4B)，因此至少从内部等位基因独立地证实了在我们的单细胞分析中检测到的Sox2 mRNA水平的内细胞特异性增加。由于Sox2是多能性调节网络中的关键转录因子之一，这从Sox2空胚胎中EPI缺乏维持(Avilion等人，2003年)及其在诱导分化细胞重编程为多能状态(即iPS细胞)中的效用得到证明(Takahashi和Yamanaka，2006年)，我们发现其内部细胞特异性上调对于内源性多能性调节网络的建立非常重要。这种表达与其他多能性和重编程因子形成鲜明对比。Oct4 (Pou5f1)、Nanog、Esrrb和Klf4在8细胞和16细胞胚胎的几乎所有卵裂球中都大量表达(图4C)。这些转录因子对外胚层细胞的限制是由于下调其他两个胚泡谱系内的转录水平，而不是内部细胞/EPI特异性转录增加引起的。相比之下，在8细胞阶段，Sox2基因处于最低水平(从母体转录物的高水平下降)，然后在16细胞胚胎的内细胞中增加。因此，在从受精卵到多能基态的过程中(Nichols和Smith，2009)，Sox2是最后一个被转录激活的重编程因子，但也是第一个标记发育胚胎中细胞群体差异的因子。
[if !supportLists]5. [endif]从内细胞到EPI和PE
ICM形成了EPI和PE。要深入了解EPI / PE隔离机制，我们返回了我们的SingleCell数据，以确定ICM内最早的表达差异。这些差异在沿PC1（图2a）分类为ICM的细胞中，在从32细胞到64-细胞胚泡中的过渡中沿PC1（图2a）。因此，我们计算了使用50个ICM细胞在32细胞数据集中的50个ICM细胞的1035对基因（不包括用于归一化的ACTB和GAPDH）的基因表达的相关性，并且分别是55个ICM细胞在64细胞数据集中。与E3.5 ICM内的Nanog和GATA4 / 6一致（Chazaud等，2006; Plusa等，2008），我们发现Nanog/ GATA4基因对和Nanog/ GATA6基因对在64个细胞ICM细胞中表达水平与32细胞ICM细胞中的微不足道或弱相关性相关（图5A）。
实际上，几乎所有32个ICM细胞含有高mRNA水平的Nanog和GATA6，而GATA4最初是低的。通过在从32细胞转变为64细胞阶段的ICM细胞的亚群中强烈激活表达的来实现GATA4的后期PE特异性，以从32细胞转变为64细胞阶段（图5C和5D）。Nanog和GATA6的EPI和PE特异性分别是在转换到64个单元阶段的相对细胞类型中下调的结果（图5C和5D）。有趣的是，早期ICM（32细胞）细胞之间具有最强逆相关性的基因对并不涉及TFS，而是编码配体/受体对FGF4 / FGFR2（图5A），这考虑到它们的必要性非常重要在原胚层形成中的作用（Arman等，1998; Feldman等，1995）。据我们所知，这是第一种证据表明这些基因在早期的ICM内。显然通过FGFR 2的减少（在16细胞阶段高度表达）和32细胞ICM细胞亚群中的FGF4（在16细胞阶段的低）增加（图5B-5D）中的FGF4（低于16细胞阶段的低温）的逆相关性（图5B-5D） 。在64个单元ICM内，FGF4仅限于EPI和FGFR2至PE（图5B-5D）。
为了在ICM发育监管网络的背景下定位FGF信号，我们特异性FGFR抑制剂SU5402桑葚胚（E3.0）期间到胚泡（E4.0）的胚胎与，一种提高ES细胞衍生效率的治疗方法（ying等，2008）。我们用我们的曲线标记分析了个体胚泡，虽然没有作为单细胞分析的全面洞察，但我们可以根据我们的野生型单细胞数据推断出谱系特定的转录组变化。值得注意的是，与载体对照相比，所有抑制胚胚状物表明大多数PE特异性发育调节剂的表达（例如GATA4，SOX17）显着降低。这与EPI特异性标记相反（例如，纳米和ESRRB），其中许多呈现出2至4倍上调（图6A）。特异性基因如CDX2，GATA3和KRT8不受FGF信号抑制的影响。有趣的是，PE标记GATA6的水平仍然没有妨碍，表明该PE特异性标记的表达与FGF信令无关。FGATA6发育过程的表达水平表明其升高的表达在FGF4 / FGFR2逆相关性之前（图6B）。这与Plusa等人的研究结果一致。 （2008）。该GATA6表达式与GATA4（图6B）和其他PE标记（图S4）相反，其中在建立FGF4 / FGFR2逆相关之后发生体积特异性上调。通过FGF抑制的PE形成由最近的另一个研究支持（Nichols等，2009）。我们的数据指明FGF信号上调PE特异性的TFS GATA4，SOX17和CREB3L2的转录上游。
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