2022年7月11日，浙江大学郭国骥/韩晓平教授团队在国际权威期刊Nature Genetics (IF=41.3069) 上发表了题为“Systematic identification of cell-fate regulatory programs using a single-cell atlas of mouse development”的最新成果，研究从单细胞水平上构建了小鼠发育过程中谱系分化的细胞图谱，结合4D蛋白质组学技术，描绘了小鼠谱系发育和成熟过程的细胞状态流形图，并揭示了控制细胞命运决定的基因调控网络。
文章概述
该研究在单细胞水平构建了发育过程中小鼠谱系分化的细胞图谱，并描述了细胞类型成熟过程中谱系共同和谱系特异性调节程序。还发现在无脊椎动物和脊椎动物的发育过程中广泛活跃的谱系共同调节程序。特别是，确定了Xbp1是不同物种细胞命运决定的进化保守调节因子。证明了Xbp1转录调控对于稳定多种小鼠细胞类型的基因调控网络非常重要。该研究结果为细胞基因调控程序提供了遗传和分子方面的见解，并将作为进一步推进细胞命运决策理解的基础。
研究结果
小鼠细胞分化图谱（MCDA）的构建
作者对小鼠从早期胚胎阶段到成熟成年阶段的七个生命阶段进行了单细胞转录组学分析：胚胎期（E）10.5、E12.5、E14.5、出生后（P）0、P10、P21和成年。共分析了520000多个单细胞（图1b）。包括分布在不同系统中的器官：大脑、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肺、胰腺、胃、睾丸和子宫。对每个组织相邻阶段的差异表达基因（DEG）的分析表明，不同阶段的组织成熟临界期不同。从P0和P10样本中观察到许多不同的亚群，表明出生后细胞继续转变。
图1 小鼠分化的单细胞转录图谱
小鼠发育过程中的细胞变化
以肾脏的动态变化为代表进行研究。分析从E10.5至成人阶段的肾脏样本，定义了30个具有典型标志物的聚类，其中包括基质细胞、肾单位上皮细胞、开窗内皮细胞和免疫细胞（图2a）。值得注意的是，UB细胞和NPC包括P0期的细胞，而远端和近端SSB细胞包括P10期的细胞（图2b）。这一结果表明，小鼠的肾脏生成在出生后继续，而不是在出生前完成。此外，肾功能的成熟持续到成年阶段，并逐渐发生生理变化。
为了揭示发育过程中小鼠组织中的细胞异质性，对不同阶段的每个组织进行了t-SNE和差异基因表达分析。发现了37个先前未被识别的细胞群体，它们具有与小鼠发育相关的有趣的基因表达模式。鉴定了在P0阶段在肠和脑中共同表达肌细胞（Myl9，Acta2）和内皮细胞（Esam，Gng11）标记物的细胞（图2c，d）。Myl9和Esam的共同免疫荧光进一步证实了scRNA-seq结果（图2e，f）。
总之，具有共表达或异位表达模式的祖细胞池可能广泛存在于发育中的器官中，这提示了哺乳动物在终末分化前的状态多样性的复杂性。
图2 小鼠组织中的细胞异质性
MCDA中调控机制的表征
为了识别细胞身份的关键转录因子（TFs），利用数据驱动（SCENIC）32和数据库衍生（VIPER-DOROTHEA）方法来估计TF的活性。基于单细胞数据集，检测组织特异性TF的灵敏度达到>75%。确定了900多个TF，置信水平从A（高置信度）到C（低置信度）。结果表明，这些谱系共同TF在一系列小鼠细胞类型的成熟过程中起着重要的调节作用。
图3 MCDa中调控机制的分析
跨物种细胞命运决定过程中的全局特征
了探索跨物种发育中的常见变化，进行了熵分析，发现所有七个物种的熵随着发育而降低，这表明转录稳定性的增加在进化上是保守的（图4a-f）。发育过程中下调的基因富含核糖体蛋白质基因、线粒体核糖体蛋白基因和小核核糖核蛋白基因（图4g）。值得注意的是，Myc和Mycn作为核糖体生物发生的调节剂，在小鼠发育的早期阶段显示出高活性分数（图4h）。结果表明，核糖体蛋白质基因是干细胞的一个保守特征，在细胞类型分化过程中它们被下调。另一方面，上调基因在免疫途径中高度富集，这与最近关于人和小鼠成体组织的报告一致。介绍了从无脊椎动物到脊椎动物的谱系发育过程中的一系列共同特征；特定的核糖体蛋白基因在分化程度较低的细胞中富集。
图4 跨物种细胞分化的全局特征
跨物种细胞命运决定的基因调控网络
对于不同物种间的谱系共同调节因子，研究发现几种常见上调的TF表现出显著的收敛性，包括XBP1、JUND、FOSB、JUN、BHLHE40和其他（图5a），与各种成年小鼠组织中的富集TF一致（图3c）。这些TF还与人类细胞图谱（HCL）中富含谱系特异性祖细胞（GATA1、PAX6、NKX6-2、NEUROD1、SOX10、OLIG2）的TF表现出强烈的负相关，HCL是由Microwell-seq14生成的人类综合细胞图谱（图5b）。怀疑这些TF可能作为进化上保守的调节因子，引导多系细胞分化和成熟。作者发现，在所有七种物种中，只有一种TF Xbp1突出（图5a）。作为一种假定的共同调节因子，Xbp1显示了大多数MCDA谱系中的上调表达模式（图5c）。从细胞图谱的角度进一步剖析了其调节作用，并发现干细胞调节因子如SOX4、SON和HES1与HCL中的XBP1最负相关（图5d）。此外，在使用小鼠和人类（图5e，f）的测序（scATAC seq）数据进行的转座酶可及染色质单细胞分析中，造血祖细胞和神经祖细胞中的XBP1结合基序的富集程度低于其相应的成熟细胞类型。
图5 跨物种细胞命运决定过程中基因调控的推断
Xbp1作为多谱系进展中的常见调节因子
Xbp1的破坏导致小鼠胚胎获得更多祖细胞状态。了表征蛋白质水平的功能丧失变化，对WT和敲除（KO）胚胎进行了液相色谱-质谱（LC-MS）蛋白质组学分析。Xbp1−/−胚胎表现出更高表达水平的多能相关蛋白，如Lin28a、Lin28b、Pcgf6和Jarid2，以及更低表达水平的细胞类型特异性蛋白，如神经细胞中的Snca、基质细胞中的Clu、肝细胞中的Afp、巨噬细胞中的C1qb和红系细胞中的Blvrb（图6f）。
图6 ScRNa序列和高分辨率质谱显示Xbp1−/−胚胎中的基因和蛋白质变化
总结
研究从单细胞水平上构建了小鼠发育过程中谱系分化的细胞图谱，结合4D蛋白质组学技术，描绘了小鼠谱系发育和成熟过程的细胞状态流形图，并揭示了控制细胞命运决定的基因调控网络。
参考文献：
Fei L, Chen H, Ma L, E W, Wang R, Fang X, Zhou Z, Sun H, Wang J, Jiang M, Wang X, Yu C, Mei Y, Jia D, Zhang T, Han X, Guo G. Systematic identification of cell-fate regulatory programs using a single-cell atlas of mouse development. Nat Genet. 2022 Jul;54(7):1051-1061. doi: 10.1038/s41588-022-01118-8. Epub 2022 Jul 11. Erratum in: Nat Genet. 2022 Aug 3;: PMID: 35817981.
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