细胞冻存技术
1. 细胞冻存是将细胞储存在低温环境中，减少细胞代谢，实现长期储存的一种技术。
2. 在大多数细胞系中，细胞会随着衰老和演化不断的积累改变，造成表型和基因型的“培养漂移”，在冻存过程中，适当的操作和合适的冻存条件可以减少细胞特性的改变或丢失，起到细胞保种的作用。因而，正确且成功的冻存对于细胞的长久应用起着非常重要的作用。
细胞冻存原理
1. 当温度低至-70℃时，细胞内的酶活性全部停止，代谢活动停止，故实现长期保存的目的。
2. 随着温度降低，细胞内外的水分都会结晶，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏，从而引起细胞死亡，特别是0~-20℃的阶段，冰晶呈针状，及其引发细胞损伤。在不加任何保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
3. 常见的冷冻保护剂是甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。
保护剂的选择
1. 细胞冻存中， 一般使用DMSO 作为保护剂。在细胞冻存中， DMSO 使用的最终浓度一般是 5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。
2. 对特别敏感的细胞在冻存时需测试适用的冻存液。例如神经元细胞冻存时需选择无血清冻存液，避免复苏后分化。
为什么要进行细胞冻存？
· 有限细胞系形态及代谢活动维持
· 珍贵细胞保种
· 细胞株标准品制备
· 脐带血干细胞、NK细胞冻存
细胞冻存的最佳时期
1. 用来冻存的细胞一般选择在细胞对数生长期，汇合度约 90% 的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液。
2. 对培养物进行微生物污染物检测，特别是支原体，确保细胞没有任何的污染。在细胞的收集过程中，实验操作要尽可能的温和，避免细胞受损。
细胞冻存的速率
1. 细胞的冷冻速率最适控制在让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导致细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的。
2. 梯度降温法：4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱冷冻过夜，次日将冻存管转移到液氮罐中长期保存。
3. 细胞程序降温盒，将准备好的细胞冻存管放进冻存盒，直接在-80℃过夜后就可以转移至液氮罐中。
4. 在转移存放位置的过程中一定要迅速，转移时建议将冻存管放在干冰中恒温，尽量避免转移过程因温度变化对细胞活力的影响。
冻存环境
1. 细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。
2. 细胞长期保存温度是 -130 ℃或更低。
3. 液氮罐中气态层温度在 -140℃至 -180℃之间，细胞可保存在气态层或浸入液氮中，如果可能最好保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸(但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加)。
HyCyte™一步冻存液
HyCyte™冻存液是一种即用型、无血清、无需程序降温的细胞“长期”冻存液，该产品配方使用已超过15年，原料均从日本进口，冻存品质与日本产品一致。
· 安全：无血清，不含异种动物成份
· 广谱：适合多种细胞类型
· 高效：复苏后细胞保持高活性及快速增殖 能力，不影响细胞功能
· 方便：即用型，无需额外配制，无需程序降温盒及稀释
一步冻存液使用流程
一步冻存液的作用机理:
细胞膜保护剂—可在细胞膜外瞬间形成一层保护膜，保护细胞不受细胞外冰晶的损害。
渗透性保护剂—可迅速渗透至细胞内部，防止细胞内部产生大量冰晶，同时可保护细胞器，减少其在低温下的损伤。
细胞沉降稳定剂—可平衡细胞沉降速度，防止细胞在冻存过程中聚集成团。
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