细胞培养的无菌技术

微生物无处不在，它们造成污染的可能性也处处存在。细胞培养成功操作最基本的要点是：任何与细胞接触的物品必须是无菌的或没有污染的。要解决培养过程中的污染问题是一件繁琐的、令人沮丧的、没有成功把握的工作，因此，最好的策略就是防止微生物污染的发生。

方案 1 无菌技术

无菌技术在理论上是很简单的：阻止无菌的、未被污染的物质或物品与任何有菌的、被污染的物体相接触。成功的无菌技术的一个基本因素就是个人卫生。任何直接或间接地与培养相接触的物品必须无菌。理想化的情况是所有无菌操作都应该在一个层流式超净台中进行。如果是在一个敞开的空间进行无菌操作，火焰灭菌则通常是一种直接的、局部的灭菌方法。由于火焰形成的湍流会极大地打乱无菌气流，因此火焰灭菌法应尽量少用。

材料

抗菌肥皂

70 ％乙醇或其他适当的消毒剂

95 ％乙醇

洁净的袖口紧缩的实验室工作服

手术用乳胶手套

清洁宁静的工作间

盛有消毒剂的废物收集盘

酒精灯

无菌操作前，束紧长发于脑后。用抗菌肥皂充分刷洗手和胳膊至少2min 。

要依据培养的细胞或组织选择适当的工作服。为保证无毒、无菌条件，应穿洁净的、袖口紧闭的实验服，戴乳胶手套。无菌操作过程中，还应经常地用70 ％乙醇消毒戴着手套的双手。

在动物病毒培养工作中，要使用四级铵化合物。

使用后的手套用高压消毒锅消毒，不可重复使用。专门用于培养的工作服穿过后要装进包装袋进行高压灭菌。装袋、高压灭菌（如果必要）和洗涤其他实验室工作服应在专设的房间内完成，或是送到有能力处理生物性污染的洗衣店清洗。

脱掉防护手套后彻底冲洗双手。

所有的无菌操作都应该在一个洁净的工作间内进行，不存在污浊的气流和穿堂风。层流式洁净间为无菌操作提供了一个最适的可控制环境。

对将参与无菌操作的各种物品的工作空间要进行清洁。使用前后要用70 ％乙醇或其他适当的消毒剂处理工作面。

无论怎样，当所用物品介入洁净工作间时都要用消毒剂处理。按照从洁净到污物的顺序合理安排各种物品，以防污染物件对清洁物件的交叉污染。

任何细小的污染物应立即投入到消毒盘内。无菌工作完成后，及时清理各种较大的污物或其他要想处理的废弃物，并放置在指定的包装袋或盘内，然后高压灭菌。工作间参照步骤6 进行消毒。

用右手操作的人员，左手以约45° 的角度持培养瓶（或尽可能地不使内容物流出），轻轻地移去瓶帽。切勿将瓶帽的任何部分碰触不洁物体（如手或工作台）。瓶口在酒精灯火焰顶端缓慢通过，烧毁污染物。

以一定的倾斜度静握培养瓶，用灭菌吸管缓慢地加入或吸出溶液，避免形成气泡。重复火焰灭菌，待瓶口略略冷却，盖上瓶帽。

与相关物品接触的器械的关键部分浸泡于95％乙醇中。从乙醇中小心取出器械时，切勿碰触其洁净部位。待乙醇自然挥发后，持器械在喷灯火焰上通过，去除残留的乙醇。器械使用前，切勿碰触任何未经消毒的物件，冷却10s 后再用。

警告： 95 ％乙醇是易燃品，乙醇容器要置于一定范围的安全处而远离明火。

器械使用完毕后重新浸泡在乙醇消毒剂中，以备使用。

手握接种环柄，于中间部位开始在酒精灯火焰上前后移动烧灼金属圈，直至出现橘红色，然后冷却至室温（约10s) ，待用。

完成接种后．重新烧灼接种圈，清除残余的生物活性物质。冷却至室温，放置备用。

方案2 层流式超净台的使用

层流式通风橱（超净台）设备是一种物理防护设备，是防止从操作者或外环境中传播污染的初级屏障，还能保护实验室工作人员和环境免遭感染或有害物质的侵袭。水平层流式超净台的使用可以为处理干净的（也就是未污染的）材料（如过滤培养基）提供一个近似无菌的环境，但它决不能用于处理感染物质或有毒的化学物质。生物安全柜不仅为操作者和实验对象提供一个干净、安全的场所，在无毒的或无放射性化学物质存在的情况下，它还适用于接触低（或中）等风险生物因子的工作。

材料

70 ％乙醇或其他消毒剂

水平式层流超净台，有合格证明

棉拭子（如脱脂棉或纸巾）

酒精灯

彻底清洁层流式超净台的工作面，用70 ％乙醇或其他消毒剂对工作台面及左右两侧进行消毒。不要向HEPA 滤板格栅（背面）喷洒消毒剂。

用前，打开吹风和照明系统，使柜内空气循环10min。将实验特需物品放置到柜内，并于用前以70 ％乙醇或其他消毒剂擦拭。

使用超净台前彻底洗手，穿洁净的实验工作服，戴手术用手套，以防皮肤上的细小物质脱落产生污染。

在水平式超净台内工作应注意：

4a. 在台内的所有操作都应在距前挡板之后至少4in*的空间进行，避免快速运动而引起空气涡流。尽可能避免物品或双手从台内出出进进。

5a. 如果在超净台内需要火焰消毒，请使用触发式小火苗喷灯。但勿使喷灯长久燃烧。

6a. 工作完成后，从台内撤出所有物品，清理任何溅出的污物，用70 ％乙醇或其他消毒剂擦拭台面；继续吹风10min ，然后关闭吹风和照明系统。

使用垂直式层流超净台应注意：

4b. 提升前观察窗，将实验所需物品放入台内，用70 ％乙醇或其他消毒剂擦拭每件物品。按照从洁净到沾污的顺序排放物品。在台面的一侧放置干净的吸管、培养瓶和无菌培养液；另一侧放置废物盘、废弃的培养物和其他废弃物。

5b. 将观察窗提升距操作水平面约8in。开始工作前，过滤台内空气保持吹风约10min；工作中，所有操作均应在观察窗后至少4in 的空间内进行，最大限度地减少快速运动或活动。保持观察窗开启大约8in, 这样物品可以轻易地进出。

6b. 如果需要直接用火焰消毒，请使用电子点火或触发点火喷灯。请将喷灯摆放在工作空间后边。

7b. 操作完毕，密封所有污染物，以70 ％乙醇或其他消毒剂擦拭工作面，尤其要仔细清除培养悬液或培养基污渍，它们有可能成为以后的污染源。清洗从台内取出的物品。继续吹风约10min 以上，消除气溶胶，同时关闭荧光灯，打开紫外灯消毒至少30min 。