TACO - 使用cuffmerge进行转录本拼接时你可能还不知

在分析RNA-seq数据时，你经常可能会需要使用cufflink或stringtie两个软件进行转录组组装，用于预测新的转录本，这两个软件是RNA-seq分析中进行有参转录本组装的最最最常用到的软件了，同时他们也自带了工具（cuffmerge和stringtie -merge）用于将组装好的转录本进行拼接，经典分析流程基本上就是：

tophat + cufflink + cuffmerge + cuffdiff

histat2 + stringtie + stringtie -merge + ballgown

但是本文需要讨论的问题是 转录本拼接 的问题，因为我在这里踩了大坑！！而且我差点没发现，而且我觉得你可能也不知道！！！要是你想了解RNA-seq分析的方法及脚本，请参考下方链接，点击阅读原文，有一个RNA-seq 详细说明文档

https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzUzNjA5MzA1Nw==&mid=2247483662&idx=2&sn=47cd3440885cd4344e490f240b31857b&chksm=fafac9e0cd8d40f65e8d31d00ed743215356226a33292a6bad94d46ba605d8acdfef25814e6f&token=1289499600&lang=zh_CN#rd

在RNA-seq分析时，像往常一样，因为我需要预测新的转录本，且这次组装的样本比较多，考虑到软件组装速度，所以这次使用的是stringtie而不是cufflink，组装完成后我就使用了strintie -merge进行拼接，结果问题就来了！我查看了拼接好的gtf文件，内容如下图一，方框中AT4G25470，AT4G25480，AT4G25490是串联排列在同一条染色体上10kb区域内的三个基因，当进行转录本拼接后他们被拼接成了一个基因名为MSTRG.16211。这三个基因在拟南芥受冷处理后会迅速诱导表达，对植物耐冷十分重要，而此时他们却被拼成了一个基因，对于后续定量影响很大，这可怎么办？！我想基因组那么大，邻近的基因那么多，被拼接成一个的应该也不止这一个例子吧，只能看看其它方法了

确实，通过查文献我发现在17年就已经有文章报道过了，文章发表在nature methods上（题为：TACO produces robust multi-sample transcriptome assemblies from RNA-seq），作者开发了一个新的拼接软件 TACO，用于对cufflink或stringtie组装好的转录本进行拼接，如下图二，只是在拼接（meta-assemble）时使用 TACO

作者测试了三种方法，得出的结论是，当样本数小于10个时，三个方法没有太大区别，但是当样本大于10个时，cufflink和stringtie的指标会急剧下降，而TACO几乎没什么变化，当样本量更大时TACO同样表现出色。作者举了一个例子如下图三，染色体三上距离十分相近的三个基因，当样本到500时，cuffmege基本上已经认为这三个基因是一个基因了，而TACO仍能很好的识别，所以使用TACO进行拼接吧

文章链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/?term=TACO%20produces%20robust%20multi-sample%20transcriptome%20assemblies%20from%20RNA-seq

微信公众号：生信自修室