国家自然科学基金委员会生命与医学板块于8月发布 “肿瘤免疫与肿瘤代谢”原创探索计划项目，其中一资助研究方向便在于肿瘤代谢干预新靶点的发现，以更好探索肿瘤代谢与免疫治疗之间的关系。今天小编想和大家分享的便是一篇与肿瘤代谢和免疫浸润高度相关的文章，主要是基于代谢-蛋白质互作（MPIs）构建肝癌MPIs网络，并进行肝癌分型与代谢和免疫相关机制分析。本篇文章于2021年7月发表在Advanced Science上，影响因子高达16+，综合全面但又不失细节，看标题“其貌不扬”，有点常规，但是细品很有意思哦。
基于代谢-蛋白质互作网络构建稳健的肝癌预后相关亚型
Identification and Characterization of Robust Hepatocellular Carcinoma Prognostic Subtypes Based on an Integrative Metabolite-Protein Interaction Network
1.构建MPI网络
研究者首先从KEGG、Reactome、Human-GEM和BRENDA四个数据库中提取代谢-蛋白质互作（MPIs）关系(图1a)。整合四个数据库中的MPI关系，构建出由1870个代谢物和4132个蛋白(编码基因表示)组成的定向蛋白质互作网络(图1b)。该网络中包含许多在癌症中发挥关键作用的蛋白质，包括IDH1、PTEN和KRAS等(图1b)。富集分析结果表明与大多数代谢物相互作用的蛋白(MIPros)参与代谢相关过程，其中一些还与内分泌系统、信号转导、免疫系统等过程相关(图1c,d)，表明代谢物可以通过与多种蛋白质相互作用参与细胞过程。
图1.整合的MPI网络
2. Pan-Cancer分析识别出HCC特异性的代谢改变
基于主成分分析(PCA)方法对TCGA中包括HCC在内的13种肿瘤中核心MIPros (MPI网络中有4个以上邻居的MIPros)的mRNA在肿瘤组织和正常组织中的表达进行分析。主成分分析表明HCC显示出最独特的代谢模式(远离其他癌症类型，图2a)。另外，与其他12种癌型相比，HCC中的MIPros可以更多的富集到在癌症-正常样本中发生差异表达的基因与癌症预后相关基因中(图2b,c)。此外，通过基因集富集分析(GSEA)评估每种癌症类型中肿瘤和正常组织之间的通路水平改变(图2d)，分析结果表明HCC在13种癌症类型中表现出最显著的代谢改变(当聚类数K = 3时，HCC被聚为一个孤立的类，图2d)。与癌旁组织相比，HCC肿瘤组织中出现大量代谢通路下调，该结果可以在四套独立的HCC数据中被观察到，包括TCGA，LIRI-JP和两套来自于GEO的数据集 (图2d)。
图2.13种癌症类型中肿瘤和正常组织间的代谢变化
3. 基于MIPro表达谱识别在预后和缺氧方面存在差异的HCC亚型
以上分析表明，HCC与其他癌症类型相比具有明显的代谢特征。同时，HCC内部也存在高度代谢异质性。为体现代谢异质性，研究者基于PCA分析对核心MIPro进行降维，并基于一致性聚类方法将HCC聚类为两个亚型。其中C1亚型的预后明显比C2差(图3a,b)。对其他癌症类型也进行同样的分析，KIRC和UCEC的不同亚型间也存在预后差异，而HCC的预后差异最显著(图3c)。
为探究两种HCC亚型间的分子差异，研究者进一步识别在某种亚型中特定富集的体细胞突变。其中，C1亚型富集到更多的TP53、BAP1等已知抑癌基因突变，而C2则富集到更多的CTNNB1等基因突变(图3d)。同时，研究者还基于随机森林算法识别出在HCC亚型划分过程中发挥作用最大的基因，并将其定义为亚型特异基因(图3d)。研究者利用排名前30的的亚型特异基因，通过lasso回归模型进一步构建分类器，并将此亚型分类器应用于其他独立的HCC数据，不同数据中可以观察到两种亚型间具有一致的表达改变(图3e)和临床预后差异(图3f)。
此外，研究者还识别出与子类型相关的PPI网络模块(图3g)。其中C1亚型中CAT中心模块下调。该模块成员主要为过氧化物酶体(图3g)，其相互作用的代谢物在多个代谢途径中富集，特别是脂肪酸相关途径。过氧化物酶体与脂质代谢密切相关，因为它们能够进行脂肪酸氧化和脂质合成。C1中过氧化物酶体的下调表明其脂肪酸氧化和脂质合成过程受到抑制。
研究者还对两种亚型在蛋白质组水平的差异进行分析(图3e)。在C1中上调的蛋白主要参与HIF-1、PI3K/AKT和胰岛素信号等生物学过程。HIF-1信号通路上调提示缺氧状态。相应地，C1亚型的缺氧评分明显高于C2(图3h)。在C1中，趋化因子信号通路等多个免疫相关通路也发生上调。
此外，两种HCC亚型在体重，年龄等方面也存在显著差异 ，在TMB 和HBV/HCV感染或肝纤维化严重程度上不存在显著差异(图3h)。
图3.HCC亚型的识别
4. 不良预后亚型与代谢通路的DNA甲基化、免疫通路的上调和脂肪酸积累有关
在四套HCC数据中都可以观察到，与C2相比，预后不良亚型C1中的代谢通路发生较大范围下调和多个免疫通路的上调 (图4a)。DNA甲基化与基因表达沉默有关。研究者对两种亚型之间的DNA甲基化进行比较，最终发现与C2相比，C1的多个mRNA都发生超甲基化，表明C1代谢通路的下调可能是代谢酶的超甲基化所致。免疫和代谢之间呈现负相关关系（图4 b, c），且C1亚型表现出更高的免疫相关分数（ImmuP，图4d）。这些免疫通路的上调不能简单的从DNA甲基化水平改变的角度来解释，表明代谢改变和免疫调节之间一定有其他机制的联系。
此外，研究者还利用定向MPI网络来估计不同亚型中代谢物的变化。以亚油酸为例，研究者提取亚油酸的定向MPI子图，并根据C1和C2亚型之间连接蛋白的表达差异来评估C1亚型相对亚油酸的积累。由于能消耗亚油酸的MIPros (CYP2A13、CYP2B6、CYP1A1等)在C1中明显下调，而催化亚油酸生成的MIPros (CEL、ACOT7、ACOT4等)要么上调，要么轻微下调，因此研究者推断C1亚型的样本比C2更有可能积累亚油酸。同样，脂肪酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成途径的代谢物，如花生四烯酸和亚油酸，更有可能在C1中积累，而碳代谢的代谢物，丙酮酸代谢等更有可能被消耗(图4e，f)。为验证结果，研究者使用一套同时检测转录组学和代谢组学的HCC数据集，首先利用转录组学数据划分C1和C2亚型，并基于代谢组学检测两亚型之间的代谢物是否存在显著差异，实验结果和上述估计一致(图4e，f)。
不饱和脂肪酸已被发现可促进HCC的增殖和进展，这一结果与不饱和脂肪酸在预后不良亚型中的积累一致。鉴于C1亚型中细胞周期通路显著上调 (图4a)，研究者推测C1缺氧亚型中癌细胞的快速增长可能取决于代谢产物的积累，尤其是不饱和脂肪酸,而不是糖酵解生成的代谢产物。此外，研究者还假设积累的代谢物(图4f)可能在上调HCC免疫通路中发挥一定作用。
图4.代谢和免疫调节之间的相互作用
5.基于MPI预测模型识别潜在的连接代谢和免疫调节的MPI
为验证C1中积累的代谢物可能通过与相关蛋白相互作用而诱导免疫通路上调的假设，研究者开发出一个MPI预测模型，以帮助识别链接代谢通路与免疫系统之间的关键MPI。该预测模型利用6个基于网络的关联特征来描述代谢产物和蛋白质之间的相互作用(图5a)，结果表明存在互作关系的代谢物和蛋白质之间的关联性明显高于随机配对(图5a)。因此，研究者开发出一个基于随机森林的MPI预测模型(图5b)，该模型的AUC值可以达到0.97，具有较高精确性，MPI和随机代谢-蛋白对大多可以通过预测概率分离(图5c)。
基于该MPI预测模型，研究者发现一些置信度较高的的MPIs (图5d)，除已知的有限代谢相互作用外(图5e)，研究者还发现多个参与免疫系统并在C1中上调的蛋白与各个方面的代谢物存在相互作用，尤其是碳水化合物和脂质代谢(图5d)。例如，CTLA4，一个著名的免疫检查点，可以阻止T细胞攻击其他细胞，被预测为会与参与不饱和脂肪酸生物合成和肌醇磷酸盐代谢的代谢物相互作用。PDCD1(又称PD1)可以与精氨酸生物合成或脂肪酸降解等代谢物相互作用等。此外，不饱和脂肪酸的生物合成也与这些免疫调节因子有较高的相关性(图5d)。研究发现，SRC、CTLA4、IKBKE和TGFB1(上皮-间质转化的关键诱导物，也参与免疫功能)与各种脂肪酸和辅酶a (CoAs)存在相互作用(图5f)。
图5.潜在连接代谢和免疫调节MPI的预测
6.亚型间免疫微环境的差异
研究者基于xCell工具，根据组织样本的RNAseq数据，预测64种不同类型细胞在TME中的富集程度，估算HCC样本的TME组成。并对C1和C2亚型患者间的TME进行比较（图6a）。结果表明C1亚型可能有更多的免疫细胞浸润，同时PDCD1、CTLA4等多个T细胞耗竭标志物在C1中表达显著升高(图6b)，说明C1亚型中浸润的T细胞主要为耗竭T细胞。C1亚型的整体间质评分低于C2，而C1的免疫评分和肿瘤纯度则更高(图6c)。
研究者还进一步整合单细胞数据，以评估免疫细胞是否也显示出类似的代谢模式。研究者基于细胞数据集(GSE98638)将HCC T细胞分类为C1和C2亚型样细胞。研究者发现C1亚型类似CD8+ T细胞的PDCD1表达显著升高，过氧化物酶体CAT的表达显著降低(图6d)，进一步从单个细胞的角度证实免疫反应与CAT相关代谢调节之间的联系。此外，研究者还基于CCLE中HCC细胞系的表达数据，划分C1/C2亚型样肝癌细胞系，并检测不同药物在两种亚型之间产生的不同治疗效果，与C2样HCC细胞株相比，C1样HCC细胞株对SRC抑制剂saracatinib更敏感(图6e)。
由于C1亚型样品的TME组成波动较大(图6a)，根据TME分布图，研究者将C1亚型进一步划分为S1和S2两个亚种群。有趣的是，S1的预后最差，C2的预后最好，S2处于中间状态(图6f)。同时，通路分析显示，与S2相比，S1各个代谢通路的mRNA水平均发生下调。三种亚型在缺氧及多种免疫相关蛋白(SRC、MMP1、IL12A等，图6g、h)中均逐渐显著降低，为S1亚型提供潜在的治疗靶点。同时，S1亚型也比S2亚型更容易积累不饱和脂肪酸(图6i)。并将这三种重新定义的亚型与另外两种HCC亚型定义方法进行比较，发现本方法划分的亚型间存在最显著的生存差异 (图6f)。
图6.HCC各亚型的TME特征
7. HCC中两种主要HCC亚型的代谢和免疫特征验证
考虑到C1亚型缺氧分数显著高于C2，研究者分别在缺氧和常氧条件下利用SNU449细胞系培养模拟C1和C2亚型，并基于转录组和代谢组学对两个肝癌亚型的特性进行验证(图7)。转录组学分析表明，缺氧组多个免疫系统通路上调，多个代谢通路发生下调(图7b)， ALDH1B1、GCDH、LIPG等多种代谢酶明显下调(图7c)。同时，在HepG2细胞中，预计SRC与某些不饱和脂肪酸相互作用，对C1亚型的免疫调节起关键作用(图5f)，其表达水平也随着缺氧处理显著升高(图7d)。
从代谢组学的角度来看，缺氧SNU449细胞的多个脂肪酸水平较高(图7 e-f)。这些结果证实C1亚型肝癌预后不良与多种代谢途径的酶下调、脂肪酸积累以及多种免疫调节因子上调密切相关。
图7. HCC亚型特征的验证
今天的文章紧贴国自然热点资助方向，对HCC代谢-蛋白之间的互作进行充分分析，并基于代谢-蛋白互作网络中的核心蛋白构建亚型分类器，结合单细胞分析，细胞系分析以及实验分析等多种分析方法，对HCC代谢产物与TME之间关联等代谢与免疫之间的关系进行探究，是一篇非常全面综合，但又充满细节的文章，还在发愁“肿瘤免疫与肿瘤代谢”怎么做的同学一定要认真学习下哦！
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