乳腺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤，关于乳腺癌的实验千千万，如何设计一个实验，将原本平平无奇的研究与热点研究深入挖掘，获得意想不到的结论呢？来自重庆医科大学第一附属医院的研究人员发表在Theranostics（IF：11.553）期刊上一篇旨在识别和表征一种可能与BrCa预后和治疗反应相关的新的肿瘤抑制基因（TSG）的文章，下面一起来看看如何合理设计实验以得出肿瘤抑制因子 DRD2触发乳腺癌细胞焦亡的吧！
肿瘤抑制因子 DRD2 促进巨噬细胞的M1极化并抑制NF-κB 信号传导以触发乳腺癌细胞焦亡
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一、研究背景
乳腺癌晚期诊断和复发是癌症患者生存率低的两大主要原因，但仍然缺乏有效的治疗策略，而肿瘤抑制基因(TSGs)对肿瘤进展至关重要，这些基因通常被 BrCa 中的 DNA 甲基化下调和沉默。因此，本研究旨在识别和表征一种可能与BrCa预后和治疗反应相关的新的TSG，从而进一步促进BrCa的综合治疗。
DRD2属于多巴胺（DA）受体家族，是类D2受体中占主导地位的成员，越来越多的实验表明，DA 能通过激活 DA 受体来抑制肿瘤生长和转移，此外，DA受体通过参与肿瘤相关微环境(TME)的重编程来调控肿瘤的发展。然而DRD2 是否以及如何介导 BrCa 进展在很大程度上仍然未知。
因此，本文要解决的科学问题，就是回答DRD2是否是潜在的TSG及BrCa患者预后生物标志物；如果是，那么DRD2介导的肿瘤抑制作用的调控机制是什么？
二、结果
1、DRD2 通过 BrCa 中的启动子甲基化被转录下调
为了研究新的潜在 TSG，研究人员使用 BrCa 组织和正常组织分析 RNA-seq 谱和在线数据库（图 1A-C）。结果表明与正常乳腺组织相比，BrCa 组织中 DRD2 的 mRNA 表达显着下调。
紧接着，研究人员基于TCGA数据库分析BrCa患者中DRD2表达及启动子甲基化状态与病理特征的关系。结果表明DRD2 被认为是潜在的 TSG，可以代替 DRD3 或 DRD4 进行进一步研究，具体结果如下：
1. DRD2的高表达与患者年龄呈负相关。
2. HER2 阴性患者的 DRD2 表达较高。
3. DRD2 甲基化增加在老年人群中更为常见。
4. 基于 Kmplot，DRD2 的更高表达促进了 BrCa 患者及其HER2阳性患者的更长生存期，但是在 Luminal A 患者中没有看到这种优势（图1D）。
最后，根据 RT-PCR 和 MSP 结果，与永生化的正常乳腺细胞系相比，几乎所有 BrCa 细胞系中都可以看到 mRNA 表达的下调或丢失以及 DRD2 的启动子甲基化（图 1E）。
以上结果表明， DRD2 是一种潜在的 TSG，也是预测 BrCa 患者预后的有希望的生物标志物。
图 1: DRD2 通过 BrCa 中的启动子甲基化被转录下调
2、DRD2 作为 TSG 起作用并抑制上皮间质转化 (EMT)
既然发现了DRD2 是一种潜在的 TSG，那么研究人员需要进一步的研究来阐明其分子机制的细节。通过 RT-PCR (图 2A) 和 WB (图 2B) 构建并验证了具有稳定过表达 DRD2 的 MDA-MB231 和 BT549 细胞。结果如下（图2C-K）：
1. 通过CCK8测定得出，DRD2的异位表达抑制肿瘤细胞生长；单层集落形成试验和软琼脂形成试验所示，DRD2 损害了肿瘤细胞的存活能力。
2. 进一步进行细胞凋亡和细胞周期分布测定。DRD2 表达显着促进 BrCa 细胞凋亡并在 G2/M 期阻断 MDA-MB231 和 BT549。此外，DRD2 的过表达促进了 BrCa 细胞对 PTX 的药物敏感性，这表明 DRD2 还可以作为精确 PTX 治疗的生物标志物。
3. 在伤口愈合试验中，DRD2 的异位表达表现出比对照组更小的人造伤口闭合能力。
4. DRD2 的过表达显着降低了 BrCa 迁移和侵袭。
5. 敲低表达相对较高 DRD2 的 YCCB1 中的 DRD2后能促进YCCB1增殖并抑制细胞凋亡，同时促进了YCCB1的转移能力。
由于EMT在癌细胞的迁移和侵袭中很重要。因此研究人员进一步探究DRD2对 BrCa 细胞的 EMT的作用。WB 结果表明 E-钙粘蛋白的表达增加，波形蛋白以及另一种前 EMT 转录因子 ZEB1 的表达降低。IF 染色还表明 DRD2 的异位表达诱导 MDA-MB231 失去间充质标志物波形蛋白并获得上皮标志物 E-钙粘蛋白。
总之，DRD2 能够在体外和体内抑制肿瘤发生，并抑制 BrCa 细胞的 EMT。
图 2: DRD2 表达在体外和体内抑制 BrCa 细胞肿瘤的发生
3、DRD2 转染的 BrCa 促进 M1 表型 Mφ
由于DRD2已被证实参与免疫调节，因此研究人员进一步探究BrCa 中的 DRD2 是否具有将 Mφ 重编程为 M1 表型的能力。
首先IHC 结果表明，在具有较高 DRD2 表达的 BrCa 组织中，M1 Mφ 的浸润增加，M2 Mφ的滤过减少（图 3A）。
紧接着，为了进一步研究 DRD2 在调节 TAM 中的功能，研究人员构建了 BrCa 和 Mφ 的共培养系统。结果如下（图3B-E）：
1.如 qRT-PCR 所示，M1 表型的标记物增加，而 M2 Mφ 标记物被下调。
2. WB 结果确定 M1 标记 iNOS 被上调，而 M2 标记 CD206 被BrCa 细胞中的DRD2表达下调。
3. IF 染色显示 Mφ 在与DRD2表达的肿瘤细胞共培养后表现出 M1 表型。
最后，为了探索将 Mφ 极化为 M1 表型的关键调节因子，研究人员进行了细胞因子阵列分析。尽管TNF-α 和 IFN-γ 对诱导 M1 Mφ 至关重要，但该研究表明，在与 Mφ 串扰期间，表达 DRD2 的 BrCa 细胞中 TNF-α 和 IFN-γ 没有显着增加。相反，这项研究表明 DRD2 显着抑制了 BrCa 中 IL-6 和 IL-10 的表达（图3F）。
综上所述，DRD2 可以将 Mφ重新编程为 M1 表型，并在串扰期间显着下调 IL-6 和 IL-10。
图 3：DRD2 将 Mφ 重编程为 M1 表型并下调 IL-6 和 IL-10
4、DRD2 重编程的 Mφ诱导肿瘤细胞的焦亡
进一步研究中发现来自小鼠模型的带有 DRD2 的肿瘤表现出肿瘤细胞死亡数的增加（图 4A），其次，根据 TUNEL 测定，DRD2 还促进体内细胞凋亡（图 4B）。此外，Mφ在串扰期间进一步促进了 DRD2 转染的 BrCa 细胞中 GSDME 的表达（图 4C）。根据WB 结果得出（图 4D），DRD2 诱导 MLKL 的磷酸化，在共培养过程中被 Mφ抑制。
此外，DRD2 表达激活了 caspase-8，并且作为共培养的结果，Mφ 抑制了激活。由于Caspase-8 被揭示是细胞凋亡、坏死性凋亡和细胞焦亡的分子开关，故研究人员进一步假设，DRD2 可能在与 Mφ的串扰期间诱导细胞焦亡。当在 BrCa 细胞中与 Mφ共培养时，DRD2 转染的 BrCa 细胞也产生了 NLRP3 炎性体和激活的 caspase-1，这进一步产生了成熟的 IL-1β 和 IL-18，其进一步解释了表达 DRD2 的 BrCa 细胞如何在串扰期间将 Mφ 诱导为 M1 极化。
为了确定焦亡是否由 M1 Mφ 触发，使用 LPS 诱导的 M1 Mφ 培养基，结果表明 M1 Mφ仅触发 NLRP3 组装并在具有 DRD2 表达的 BrCa 细胞中切割 GSDME（图 4E）。
上述结果表明 DRD2 可以诱导程序性细胞死亡 (PCD)，包括细胞凋亡和坏死性凋亡，在与 Mφ 的串扰期间，DRD2 进一步触发了 NLRP3 炎症小体和细胞焦亡的组装。该研究还表明GSDME 而非 GSDMD 是 BrCa 细胞中 DRD2 触发细胞焦亡的刽子手。
图 4：DRD2 在与 Mφ 的串扰期间触发焦亡
5、DRD2 通过中断 TAK1 的磷酸化来限制 NF-κB 信号激活
NF-κB 信号传导的激活对于触发炎性体组装和随后的细胞焦亡至关重要。故研究人员应用实验探索DRD2对NF-κB活化的影响。实验结果如下（图5A-F）：
1. IF 染色及细胞核和细胞质的提取物均表明DRD2 抑制 p-p65 的核易位，但这种抑制作用被 Mφ 抵消了。同时，DRD2似乎与LPS处理的细胞质中的p-p65结合，并且其结合通过Co-IP和IB进一步证实。
2. WB结果得知，DRD2通过LPS刺激抑制了IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化。并且DRD2 抑制的 ICAM-1 被 Mφ上调，而ICAM-1为NF-κB 靶向基因，这意味着DRD2 在抑制 NF-κB 信号激活方面的关键作用。
3. 异位 DRD2 表达显著抑制了 Mφ 诱导的 p65 磷酸化和 IKKα/β 的上游激活。
在细胞因子诱导的NF-κB通路激活中, 其上游激酶TAK1催化IKKα和IKKβ的激活是关键的步骤。研究发现异位DRD2通过抑制其上游激酶TAK1 的磷酸化表达，从而使IKKα和IKKβ去磷酸化而抑制NF-κ信号通路。
图 5：DRD2 通过中断 TAK1 的磷酸化来限制 NF-κB 信号激活
6、DRD2 激活的 β-arrestin2 损害 TAK1 和 TAB1 的结合
在与 Mφ 的串扰期间，DRD2 被触发到内化,作为典型的 G 蛋白偶联受体 (GPCR)，DRD2 的内化诱导其衔接子 β-arrestin2 的质膜募集并增加其与 β-arrestin2 结合的亲和力。故在LPS和CM刺激下，DRD2和β-arrestin2的蛋白质-蛋白质结合（图5F-G）。内化的 DRD2 可以促进 TAB1 与 β-arrestin2 的结合，而激活的β-arrestin2 信号则破坏了星形胶质细胞中 TAK1-TAB1 的结合（图5H）。最重要的是，激活的 β-arrestin2 被证实与 TAB1 竞争性结合并进一步抑制 TAK1 的磷酸化。
7、DRD2通过下调DDX5和eEF1A2抑制NF-κB通路激活和肿瘤发生
由于异位 DRD2 表达显着抑制 p65 和 NF-κB 靶基因 IL-10 的 mRNA 表达（图6A），这表明 DRD2 在没有配体激活的情况下是 NF-κB 通路的负调节因子。因此研究人员推断除了结合激活 β-arrestin2，DRD2 还可能以其他方式抑制 NF-κB 信号。
为了研究机制，研究人员通过 Co-IP 分离了可能的结合蛋白，并应用 MS 分析来鉴定蛋白质。在 MDA-MB231 和 BT549 细胞的所有结合蛋白中，DDX5、eEF1A2 和 ICAM-1 都被证实被异位 DRD2 表达下调（图6B-C）。并且这三种蛋白质都被证明与 NF-κB 信号通路密切相关。以下结果进一步证实了异位 DRD2 表达抑制了 DDX5 和 eEF1A2 对促进 NF-κB 信号激活的显着影响(图6D-G)：
1. WB结果 证实了 DDX5 和 eEF1A2 的下调蛋白水平。
2. Co-IP 和 IB 测定得出DRD2、DDX5 和 eEF1A2 的结合在 293T 和 MDA-MB231，表明这三种蛋白质形成了复合物。
3. 该研究还揭示了 293T 和 MDA-MB231 中 DDX5 和 p50 之间的结合。
4. 在 BrCa 细胞中，DRD2 和 EGFR 的结合在 293T 和 MDA-MB231 中得到证实，并且DRD2表达下调ERBB1（EGFR）和ERBB2（HER2）表达，其均为NF-κB的靶基因。
5. 在异位 DRD2 表达的 BrCa 细胞中，发现 DDX5 促进 p-IκBα 的磷酸化并增加磷酸化 p65 的蛋白质水平。
6. 该研究还表明，eEF1A2 上调了 p65 磷酸化的蛋白质水平，而不影响 IKK 复合物或 IκBα，甚至在没有 LPS 的情况下强烈上调了 p65 的磷酸化蛋白质水平。
7. 如CCK8和Transwell®测定所评估的，DDX5和eEF1A2的异位表达也削弱了DRD2对肿瘤增殖的抑制作用。
图 6：DRD2 通过相互作用和下调 DDX5 和 eEF1A2 来抑制 NF-κB 信号
三、讨论
本研究进一步揭示了DRD2在诱导M1巨噬细胞、抑制NF-κB信号通路以及触发BrCa不同程序细胞死亡过程中的重要作用。实验结果表明，DRD2 是触发 PCD 必不可少的。但仍然需要更多的研究来探索DRD2如何链接不同的PCD并改变PCD的过程。
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