Single-cell analysis of patient-derived PDAC organoids reveals cell state heterogeneity and a conserved developmental hierarchy
对患者来源的PDAC器官的单细胞分析显示了细胞状态的异质性和保守的发育层次结构
发表期刊：Nat Commun
发表日期：2021 Oct 5
DOI: 10.1038/s41467-021-26059-4
期刊相关信息
一、背景
胰腺导管腺癌（PDAC）是最常见的胰腺癌类型。大规模的基因组研究已经确定了PDAC中反复出现的基因改变，在90%以上的肿瘤中检测到KRAS驱动突变，在50%以上的肿瘤检测到TP53、SMAD4和CDKN2A的失活突变或缺失。对PDAC的转录组分析已经产生了几种亚型分类方案，大多数证据支持 "经典 "和 "基底样"肿瘤之间的区别。
早期对人类PDAC转录特征的研究大多局限于每个病人的单个样本，而最近来自多区域采样活检或甚至单个肿瘤细胞的RNA测序数据表明，PDAC的瘤内异质性的程度以前未被重视。无论采样分辨率如何，试图在原发性PDAC中划定转录性肿瘤亚型或不同的功能细胞类型，往往被肿瘤细胞的差异所混淆，导致错误地纳入基质或正常胰腺细胞中存在的转录特征。
二、材料与方法
1.数据来源
胰腺肿瘤标本是从海德堡大学医院外科接受手术切除的患者身上获得的
2.实验流程
1） 单细胞解离和RNA测序
2） scRNA-seq数据比对和质量控制
3） 单个类器官样本的分析：原发性PDAC样本的差异表达基因用Wilcoxon秩和检验来确定
4） 莫菲特亚型分析：为了分析莫菲特亚型，使用Seurat的FindClusters功能对每个病人的细胞进行聚类；确定每个簇中 "经典 "和"基底样 "亚型的25个标记基因的平均表达量；使用Seurat中的AddModuleScore函数计算每个单个细胞的基底样（Sbas）和经典（Scla）标记基因表达的亚型得分
5） 通过互换PCA对PDAC样本进行联合分析
6） 与原发性PDAC scRNA-seq数据的比较
7） 系谱层次的推断
8） 转移灶与原发肿瘤的比较：比较来自两个转移灶（p084和p085）的PDAC器官组织与来自相应原发肿瘤（p083）的器官组织的转录组
9） RNA荧光原位杂交技术
10）基于成像的药物筛选：基于类器官的药物筛选使用"DeathPro "工作流程进行，在24个PDAC类器官系的子集上进行，包括一个来自未匹配的腹膜转移瘤（p073）和一个来自未匹配的血管周围转移瘤（p037）
11）总生存时间的比较
三、实验结果
01 - PDAC类器官由恶性导管细胞组成
为了实现人类PDAC的体外研究，作者从手术过程中采集的样本中得出了24个肿瘤类器官系，18个样本来自个体病人的原发肿瘤。在一种情况下，不同的类器官系来自同一原发肿瘤的两个胰腺部位，提供了一个生物复制（p080和p081），在另一种情况下中，通过分析一个类器官系的不同通道数产生了一个技术复制（p039和p039b）。还从一名患者的胰腺原发肿瘤中获得了两个不同的肝转移瘤的样本（p083、p084和p085），以及两个未匹配的转移瘤的样本（图1a、b）。根据组织学评估，所有肿瘤都被归类为PDAC。根据Moffitt定义的亚型，患者衍生的PDAC类器官以及9个活检样本被分类为基底样或经典PDAC；在每种情况下，PDAC类器官亚型与活检样本亚型相对应。
对所有24个肿瘤类器官系进行单细胞RNA测序，在质量控制后共得到93096个细胞的转录组信息，每个类器官系的中位数为3877个细胞，每个细胞检测的中位数为4162个基因（补充图1a）。
为了确定PDAC类器官细胞的细胞类型身份，将PDAC类器官细胞的单细胞转录组与最近的原发性PDAC的数据进行比较。在所有患者中，通过相互主成分分析和特征基因的表达，PDAC类器官细胞被统一鉴定为恶性导管细胞（补充图1b），这与之前体外培养条件促进导管细胞生长的观察一致。
补充图1 PDAC组织细胞的单细胞RNA测序
02 - PDAC器官显示患者特异性的基因表达
为了研究PDAC器官在转录水平上的区别特征，作者构建了一个所有细胞的共享近邻（SNN）图，发现来自同一患者的细胞聚集在一起（图1c），即使它们来自不同的活检或转移部位的单独处理。这表明病人之间的转录差异比病人内部的差异大，而不仅仅是由于技术批次效应。患者特有的转录谱差异也不能用个别已知的表达定量性状位点来解释（补充图1c）。
为了进一步研究PDAC肿瘤之间转录异质性的来源，作者确定了在来自每个患者的原始肿瘤细胞的类器官模型中与所有其他患者相比差异表达的基因。虽然每个PDAC类器官中高度上调的基因的表达往往是患者特异性的（图1d，e），但观察到这些基因中有许多属于相同的基因家族。对每个病人的前20个富集基因的基因家族成员的分析，不包括由特定分子域定义的基因家族，结果显示最具代表性的基因家族包括细胞表面和跨膜蛋白（CD分子、Claudins和溶质载体）、与细胞外基质相互作用的分泌蛋白（粘蛋白、kallikreins）、代谢一系列底物和潜在药物靶标的酶（丝氨酸蛋白酶、醛酮还原酶），以及I型角蛋白（图1f）。在检测到这些基因的 PDAC 类器官中，它们经常在大部分细胞中表达，但在其他细胞系中表达非常低或为零（图 1g）。由于确定的许多基因家族以前被提议作为PDAC患者的肿瘤特性和/或预后的指标，这些结果对PDAC的生物标志物鉴定有重要意义，强调需要分析来自足够大的患者队列的样本，以克服患者间的转录异质性。
图1 患者衍生的PDAC器官中的肿瘤内异质性
03 - 亚型的异质性与预后不良相关
PDAC通常被分为 "经典 "和 "基底样"转录亚型，后者的预后较差，本研究队列中的PDAC器官的大量RNA-seq将器官系分为基底样、经典和中间亚型。为了在单细胞水平上阐明亚型，对所有患者衍生的器官细胞进行了评分，以确定已公布的亚型特征的表达，每个亚型包括25个基因。总的来说，亚型注释与批量结果相关性很好。对于大多数患者来源的器官，在基于PCA的细胞聚类后，亚型特征评分在各细胞簇中是均匀的，并反映了由大量RNA-seq确定的亚型（图2a）。相反，作者鉴定了一个包含 "基底样"和"经典"细胞的患者衍生器官亚群（图2b），有相应的标记基因表达（图2c）。值得注意的是，在组织病理学评估中，表现出异质亚型特征的PDAC器官被列为WHO 3级或4级肿瘤，而具有同质亚型特征的PDAC器官被列为2级或3级（图2d）。此外，具有同质性经典PDAC的患者往往有更长的总生存期，而基底样肿瘤的结果往往是最差的（补充图1d）。因此，PDAC类器官系中"经典 "亚型标记基因的同质性富集与更多分化的肿瘤相关，这与更好的预后有关。
图2 PDAC亚型特征的表达
04 - 功能性细胞状态在不同患者之间共享
为了确定不同肿瘤之间共享的细胞状态，作者对18个原发性PDAC类器官转录组进行了基于PCA的相互整合。细胞聚类揭示了在患者中保守的九种功能细胞状态（图3a和补充图2a）。
补充图2 PDAC 中不同的细胞状态
作者通过差异表达分析评估了每个集群的特征（图3b），五个簇代表细胞在不同的细胞周期阶段移动（标记为Cycling-1至Cycling-5）。两个集群没有循环细胞（标记为Nonycling-1和Noncycling-2），但包括表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1的细胞，这些集群显示参与分泌、消化、细胞粘附和运动的基因表达增加。虽然免疫反应信号在整个非循环集群中普遍上调，但另外一个集群（标记为IFN-1）显示参与I型干扰素信号的基因的特殊表达。最小的集群（标记为CXC-1）富含表达CXC图案配体的细胞，如CXCL1、CXCL2和CXCL8，它们被认为能刺激癌细胞的增殖和迁移。IFN-1和CXC-1集群都包括循环和静止的细胞。值得注意的是，周期性和非周期性集群包含所有患者样本的细胞，但只有五名患者（p006、p018、p027、p047和p089）为IFN-1集群贡献了至少1%的采样细胞，只有两名患者（p064和p100）为CXC-1集群做出了类似的贡献。RNA原位杂交证实了IFN-1和CXC-1簇在患者衍生的培养物以及原发肿瘤中的不同代表性。
因此，所有患者衍生的PDAC器官含有循环细胞，作者将其分解为不同的细胞周期阶段（图3c），以及分化细胞，其功能特征让人想起他们的胰腺起源（图3d）。此外，一部分患者还携带具有细胞因子特异性表达的细胞簇，这些细胞因子被认为通过自分泌和旁分泌机制促进肿瘤进展（图3e，f）。手术原发肿瘤样本的RNA原位杂交对KRT19（肿瘤性PDAC细胞的标志物）、TFF3（分泌细胞和经典PDAC亚型的标志物）、S100A2（基底样PDAC亚型的标志物）和MKI67（增殖标志物）的表达显示经典亚型的TFF3表达较高，基底样亚型的S100A2表达较高（图3g，h），证实PDAC器官反映患者原始肿瘤。
图3 不同PDAC患者共享的功能细胞状态
05 - PDAC类器官中的分化层级
基于观察到整个PDAC类器官系共享的集群子集包含循环细胞，作者试图确定PDAC类器官细胞的分化轨迹。应用最近的RNA速度的概念，确定了基因表达随时间的变化，这是由每个样品中未拼接和拼接的mRNA的相对丰度所估计的（图4a）。通过马尔可夫链追踪，确定了分化轨迹的可能起始点和终点（图4b）。在所有患者中，轨迹的起点与循环群相吻合，大多数轨迹汇聚到循环-4群，作为起源的细胞群（图4b, c）。另一方面，轨迹的终点主要位于遥远的Noncycling-2群（图4b，c）。值得注意的是，当将细胞的Moffitt亚型身份与其沿谱系轨迹的位置相关联时，与循环细胞相比，“经典”基因特征在分化分泌物中富集（图4d, e）。
由于体外类器官模型与原发性肿瘤样本相比富含祖细胞样细胞（补充图1b），不同的细胞周期阶段可以在本研究数据中得到解决，作者在G1期确定了一个分叉点，在这个分叉点，细胞要么重新进入细胞周期，要么向分泌状态分化（图4f）。为了进一步研究PDAC类器官细胞的命运行为，作者计算了一个最小生成树，连接集群Cycling-1、Cycling-5、Noncycling-1和Noncycling-2中的所有细胞，并沿分叉路径为每个细胞分配一个伪时间值。除了无处不在的细胞周期相关基因外，这种方法还发现了细胞命运的潜在驱动因素；例如，GGCT（γ-谷氨酰环转移酶）和RANBP1（Ran-结合蛋白1）在重新进入细胞周期的细胞分叉点后不久就显示出表达增加，而细胞粘附基因CEACAM6和编码钙结合蛋白的S100A6则在分化的细胞中上调（图4g）。
图4 体外和体内PDAC细胞状态的分化层次
因此得出结论，PDAC类器官的生长是由大量的循环细胞推动的，这些循环细胞维持着具有分泌功能的分化后代群体。值得注意的是，这种功能层次结构在我们队列中所有患者的PDAC类器官中以及来自主要PDAC的scRNA-seq数据中都是保守的（补充图2c）
06 - 肝转移重新建立了原发肿瘤的各个方面
作者通过从两个肝转移灶（M1和M2）和同一患者的原发肿瘤（P）中衍生出PDAC类器官系，在转录水平上解决转移性PDAC的细胞异质性问题。通过交互式PCA合并三个样本的单细胞转录组数据后，确定了三个PDAC类器官系中具有不同代表性的五个细胞簇（图5a）。所有的样本都含有循环细胞，如MKI67表达所示（图5b）。PDAC的其他功能方面，包括分泌、消化酶、细胞骨架或细胞粘附基因、MHC复合体成员和推定的炎症体抑制基因，在集群之间异质性表达（图5c）。
大量的RNA-seq表明，这两个转移的类器官系比从原发肿瘤中提取的类器官系显示出更多的 "基底样 "基因表达，与早期观察到的转移组织中的 "基底样 "表型富集一致。相反，在单细胞水平上，发现即使在单个转移瘤衍生的类器官系内也有转录亚型的异质性，来自M2的细胞亚群比来自原发肿瘤的细胞亚群显示出更多的 "经典 "基因表达（图5d）。通过将两个转移衍生的类器官系的scRNA-seq数据投射到所有原发性PDAC类器官转录组的PCA上，进一步观察到分化细胞（集群 "Noncyling-2"）的耗损，特别是在M1（图5e），与上面确定的功能集群2的耗损相对应。
图5 肝转移中的功能和转录亚型异质性
这些观察结果表明，肝脏中的转移性PDAC病变重新建立了原始肿瘤的不同方面，包括在原始样本中确定的分化层次。由于M1和M2表达的基因在原发肿瘤中也被检测到，但在转移灶之间并不共享，因此观察到的基因表达模式与潜在的同质突变景观以及不同的表观遗传控制相一致，可能是由当地微环境或偶然事件驱动。因此，虽然PDAC转移灶在转录水平上比基因组水平更具有异质性，但基因表达的差异可能不是新事件的结果，对未来的靶向治疗具有令人鼓舞的意义。
07 - PDAC类器官为药物筛选提供了一个体外模型
作者应用了最近的一种基于显微镜的自动活细胞检测和量化工作流程（DeathPro）。在这个工作流程中，所有细胞都用Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）染色，以区分活细胞和死细胞；然后从投影共聚焦图像中测量死细胞（PI）和所有细胞（Hoechst 33342或PI染色）覆盖的总面积，用于计算细胞死亡（AUCd）和增殖抑制（AUCpi）的曲线下面积值。与更简单的发光细胞存活率检测相比，这种方法解决了药物诱导的细胞死亡和增殖抑制问题。在这里，作者测量了PDAC类器官的细胞死亡和增殖抑制，由临床用于PDAC治疗的六种药物诱导；这些药物是5-FU、吉西他滨、伊立替康、紫杉醇、厄洛替尼和奥沙利铂（图6a）。
5-FU和吉西他滨在筛选的所有类器官系中引起了最多的细胞死亡和增殖抑制，厄洛替尼和奥沙利铂的效果最差，尽管类器官系之间观察到药物反应的显著异质性（补充图4a）。对于每种药物，"经典"亚型基因的表达与药物治疗反应中更明显的增殖抑制相关，而药物诱导的细胞死亡与PDAC亚型的相关性较小（图6b和补充图4b）。总之，结果表明，"经典 "亚型特征与更好的药物反应和更高的分化水平有关，而预后较差的 "基底样 "特征则与细胞增殖和药物反应减少有关（图6c和补充图4c）。
图6 经典亚型基因表达与类器官药物反应有关
补充图4 PDAC组织体的药物反应
四、结论
为了研究PDAC细胞的功能特征和层次关系，作者在这里对18名患者的原发肿瘤和转移性样本的PDAC器官进行了scRNA-seq。"经典"和 "基底样 "细胞可能在同一样本中共存，而且亚型的异质性水平与肿瘤等级有关。尽管肿瘤之间存在转录差异，但患者衍生的器官共享功能性肿瘤细胞状态，这些细胞通过分化层次连接起来，也存在于原发性PDAC样本中。
网友评论