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单细胞为我们揭示了肿瘤间以及肿瘤内的异质性问题，包括肿瘤细胞的异质性，肿瘤浸润免疫细胞的异质性，肿瘤间质细胞的异质性，但是在其解离过程中，常常丢失了组织的空间信息，虽然一些原位杂交技术（MERFISH，seqFISH等）能够获取原位的信息，但是只能针对一些已知的靶点。空间转录组的出现为我们探索肿瘤提供了高质量的测序数据以及二维的位置信息。
2021年5月上海东方肝胆外科医院的研究人员发表了文章《Comprehensive Analysis of Spatial Architecture in Primary Liver Cancer》，利用10x Visium空间转录组技术揭示原发性肝癌的空间转录异质性。
1.利用空转技术解析原发肝癌的空间结构
通过截取一个直径为55μm的区域（大约包含了8-20个细胞，测序深度大概为每个spot达到3万个UMI，覆盖3千个基因，一般而言，肿瘤的测序深度会高于正常组织）。将肿瘤的空间结构分为3种基本类型（肿瘤核心T，肿瘤边界区域L，癌旁正常组织N）外加一种特殊的类型门静脉癌栓区域P。
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2.无监督聚类识别空间异质性
通过对空间数据进行无监督聚类，能够分成局限的HCC-1T，HCC-3T，HCC-4T和弥漫的cHC-1T。通过对基因集的打分可以发现，成纤维细胞和内皮细胞主要富集在间质区域，免疫细胞在肿瘤组织中的分布具有很高的异质性。
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3.肿瘤边界的微环境特征分析
通过空间连续性和表达多样性程度这两个指标，可以发现肿瘤L和T位置具有更高的连续性和较低的表达多样性；并且发现间质和免疫细胞的打分在肿瘤边界区会出现显著的下降；
作者由此推测，信号通路可能也发生了垂直于肿瘤边界的变化趋势，并通过六条经典通路的打分进行了验证；
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4.原发肝癌的肿瘤内异质性
通过层次聚类，作者将肿瘤的空间特征分成两个模块——其中模块1具有更高的细胞周期水平和代谢相关的通路，而模块2具有更高水平的炎症，血管生成，以及上皮间质转化。通过TCGA以及LCI的公共数据集验证可得，bulk水平更接近T.2区域，其预后会更好，而T.5预后则更差，提示上调的肉碱，色氨酸，乙醇，视黄醇代谢会增加细胞的恶性行为，靶向这类代谢行为和策略，能够作为HCC的干预机制。作者进一步分析了基于空转数据的细胞通讯，并猜测是这些细胞通讯过程促进了肿瘤的血管新生，增殖和迁移。
为了进一步探究是否是因为基因组变异导致了不同肿瘤的空间集簇，进行了拷贝数变异的分析。
以上的数据都指向肿瘤空间异质性存在十分广泛，这种交互的细胞通讯对于揭示肿瘤生态和演化具有重要的意义。
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5.肿瘤干细胞的功能分析
肿瘤干细胞被认为是一种重要的肿瘤异质性的来源，作者将前5%高表达干细胞基因集的点阵作为富含肿瘤干细胞的区域。通过不同区块间各类生态龛（niche）比例的改变，作者发现在肿瘤边界到癌栓的过程中CD47-，SOX9-，PROM1阳性的干细胞生态龛出现增加。
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6.一种静态异质性整体观
将这些区域进行无监督的聚类，可以分为六种空间表达集簇，4为正常区域，3/6为间质区域，1/2/5为肿瘤区域并且具有各自特异的癌症通路。并且这种异质性在早期的癌灶中就已经出现，即使在非常微小的尺度中，这种肿瘤细胞的亚群也是非对称一致的。
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7.三级淋巴结构的空间分布和临床意义
通过结合HE的图像，作者将第六集群确定为三级淋巴结构（TLS），同时选取了50个高变基因作为TLS的标记，包括乳腺癌的标记，12趋化因子，滤泡辅助T细胞，CXCL13，浆细胞标记基因。
作者发现三级淋巴结构主要位于肿瘤的边界为之，这与既往的研究结果是相符的，并且富含T细胞，B细胞和树突状细胞。
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总结
本文通过空间转录组学的方法，在原位高通量的检测了基因表达的空间异质性，在当时是通过空转技术揭示异质性的最早的研究。并且对于空间数据进行了详细的分析，并且印入了三级淋巴结构这一概念。
美中不足的是，作者并没有基于一个具体的科学问题层层递进，而是按照不同的无监督聚类分析，图谱式地进行展开，并且相应的结论也缺少生化的实验用来佐证。相关发现仍然有待进一步的探索。
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