文中英文的是不知道咋翻译合适，避免误导就粘贴了原文，能意会就行，大家有合适的翻译欢迎在评论区评论。原文链接：https://ashpublications.org/blood/article/113/16/3716/25117/Specificity-and-affinity-of-human-Fc-receptors-and

一、摘要

       不同的基因编码6种人的IgG受体（hFcγRs），其中有3种受体具有两种或者三种多态性。对于这些受体与IgG各种亚型的特异性和亲和力尚未不清楚（这是2009年的文章，09年之前可能没人做过系统比较）。这一信息对基于抗体的免疫疗法至关重要，该疗法已被越来越多地应用于临床。作者研究了IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的多克隆抗体和单克隆抗体与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB以及他们的多态性结构的结合。野生型和低岩藻糖基化的抗CD20和RhD的单克隆抗体也被测试。作者发现IgG1和IgG3可以结合所用种类的Fc受体；IgG2不能可以结合FcγRIIA-H131，也能以低亲和力的方式结合FcγRIIA-R131和FcγRIIA-V158；IgG4与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA-V158。抑制性受体FcγRIIB与IgG1、IgG2、IgG3的亲和力和其他受体相比较低。We also identified parameters that determine the specificity and affinity of hFcγRs for IgG subclasses。这些结果体现了hFcγR的特异性和亲和力与抗体的生物活性是相对应的。因此，这些结果突出了Fc受体在利用抗体治疗中出现的治疗性和治病性效果中的作用。

二、引言

        抗体发挥生物学活性依赖于它们的Fc结构与效应系统的相互作用。These are essentially complement and cells。抗体会与Fc受体的细胞结合。Fc受体可以和所有种类的抗体适配。这些受体表达在各种各样的细胞类型上并且发挥着不同的生物学功能，它们与抗体形成复合物时会发挥调节功能。大部分细胞会表达不同的Fc受体，而因为这些受体的胞内区不同，不同种类的Fc受体在细胞内会引发不同的信号通路。活化的受体具有免疫受体酪氨酸活化基序（ITAMs）。ITAMs存在于FcRγ的胞质内结构中，这是一个同源的共同亚基，与大多数激活的FcRs的配体结合亚基相关联。ITAMs也存在于2个单链激活受体的胞质内域中.抑制性FcRs是单链受体，在其胞内结构域拥有一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIM）。其他FcRs通过一个糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚插入质膜外层，不包含任何信号传递基序。FcRs与许多抗体依赖性疾病有关，是基于抗体的免疫疗法的关键分子。例如，这些包括用小鼠/人嵌合IgG1抗d20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤，以及用抗rhd的IgG1和IgG3多克隆抗体的混合物预防新生儿的溶血性疾病。然而，治疗性抗体也有潜在的危害，最近一项使用IgG4抗CD28抗体的临床试验就是例证。四种人类IgG亚型在应对各种抗原时产生的数量不同。T依赖性蛋白抗原主要引起IgG1和IgG3抗体，而T非依赖性碳水化合物抗原主要引起IgG2抗体。慢性抗原刺激，如过敏性脱敏，会引起IgG4抗体。每个IgG亚型的生物活性尚不清楚。IgG受体（FcγRs）在人类中数量惊人。它们包括高亲和力和低亲和力的受体。高亲和力和低亲和力的FcγRs都以高亲合力结合IgG-免疫复合物，但只有高亲和力的FcγRs能结合单体IgG。人类有一个高亲和力的IgG受体，即hFcγRI（CD64），以及两个低亲和力的IgG受体家族，即hFcγRIIA、IIB和IIC（CD32），以及hFcγRIIIA和IIIB（CD16）。hFcγRI和hFcγRIIIA是与FcR相关的激活性受体，hFcγRIIA和hFcγRIIC是单链激活性受体，hFcγRIIB是单链抑制性受体，hFcγRIIIB是GPI锚定的受体，其功能尚不明确。

       The multiplicity of hFcγRs is further increased by a series of polymorphisms in their extracellular domains。编码hFcγRIIA的基因的两个等位基因产生了2个在131位不同的变体，被命名为低反应者（H131）和高反应者（R131）。H131和R131等位基因在白人、日本人和中国人中有不同的分布。编码hFcγRIIIA的基因的两个等位基因在第158位产生2个不同的变体（V158和F158）。编码hFcγRIIIB的基因的两个等位基因产生2个变体在4个位置产生不同，NA1（R36 N65 D82 V106）和NA2（S36 S65 N82 I106），它们具有不同的糖基化模式。此外，编码hFcγRIIIB的基因复制可能在不同个体中产生不同数量的基因拷贝。因此，一个个体可能表达所有3个hFcγRIIIB变体（A single individual may therefore express all 3 hFcγRIIIB variants）。hFcγR多态性与自身免疫和感染性疾病有关。hFcγRIIA-R131与肾病、细菌感染以及可能的系统性红斑狼疮（SLE）的患病率增加有关。hFcγRIIIA-F158与系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎（RA）有关。

        自20世纪80年代以来，hFcγRs的亚类特异性一直被研究，也就是说，在当时没有怀疑hFcγRs的复杂性。有些研究是在hFcγRs被克隆之前进行的。其他的研究是使用表达几种hFcγRs的细胞系进行的，使用了具有不同灵敏度的几种技术。最后，大多数研究使用了人血清总IgG或人骨髓瘤IgG1。IgG2、IgG3和IgG4很少被考虑。据报道，人IgG对同一hFcγR的结合亲和力存在明显的差异，最高可达1 log。然而，这些数据却被反复发表在综述中。在这些综述中很少考虑hFcγR多态性。据报道，hFcγRIIA-H131，而不是hFcγRIIA-R131，可与人IgG2结合，但这种相互作用的亲和力未被确定。该多态性对hFcγRIIA与人IgG1、IgG3和IgG4的亲和力的影响没有被研究过。使用IgG1抗CD20抗体治疗时，在hFcγRIIIA V/V158患者中观察到了比F/F158患者更好的治疗效果，在抗原依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）试验中，V/V158供体的外周血淋巴细胞比F/F158供体的PBLs更有效地杀死抗CD20抗体标记的目标细胞。事实上，hFcγRIIIA-V158对单克隆hIgG1的亲和力比hFcγRIIIA-F158高。目前没有人研究hFcγRIIIA-F158和hFcγRIIIA-V158对其他IgG亚类的亲和力。hFcγRIIIB的NA1和NA2等位基因被认为为对全人类IgG或IgG1有相似的亲和力，但对IgG3的亲和力我的研究中却不一致。hFcγRIIIB-SH的结合特性还没有被研究。

         鉴于这些不完整的、异质的、有时是不一致的数据，作者对每个hFcγR以及所有4个亚类的人类IgG的结合特异性进行了系统的研究。These were assayed, both as monomers and as complexes, on a collection of CHO transfectants expressing comparable levels of FLAG-tagged receptors.作者研究了所有的hFcγRs，包括所有的多态性变体。还生产了所有hFcγRs的可溶性糖基化胞外结构域，并通过表面等离子体共振（SPR）测量了它们与IgG亚类的亲和力。We found that IgG1 and IgG3 bind to all hFcγRs, that IgG2 binds to 3 hFcγRs, and that IgG4 binds to 6。作者发现，抑制性受体FcγRIIB对IgG1、IgG2和IgG3的亲和力低于所有其他hFcγRs。作者还建立了所有hFcγRs及其变体对4个亚类的多克隆IgG的亲和力的层次结构。作者的数据解释了以前报道的炎症性疾病与hFcγR多态性的关系，并揭示出优化治疗性抗体的新候选策略。

三、结果

hFcRs对IgG亚类的结合特异性        

          为了分析人IgG亚类与hFcγRs的结合，作者构建了一系列表达FLAG标记的hFcγRs的CHO细胞系。这些转染体表达FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA或FcγRIIIB。多亚单位hFcγRs（即FcγRI和FcγRIIIA）与FcRγ共同表达。所有已知的多态性变体（即FcRIIA-H131和R131,FcRIIIA-F158和V158，以及FcRIIIB-NA1、NA2和SH）都包括在内（图S1）。抗FLAG与所有转染体的结合情况相当，表明所有hFcRs的表达水平相似（图1A）。抗CD64抗体仅与FcRI结合。抗CD32抗体仅与FcRIIAH131、FcRIIAR131、FcRIIB和FcRIIC结合。抗CD16抗体仅与FcRIIIAF158、FcRIIIAV158、FcRIIIBNA1、FcRIIIBNA2和FcRIIIBSH结合。mAb GB3与FcRIIB和FcRIIC结合，但不与FcRIIA结合。通过间接免疫荧光法评估人IgG与CHO细胞的结合情况。多克隆IgG制剂（100 000g超速离心）被用来评估单体IgG的结合。IgG complexed with F(ab)2 anti–human F(ab)2 were used to assess the binding of IgG immune complexes (IgG-F2 IC).在同一实验中测试了单体和免疫复合物的结合。

         单体IgG1与FcRI的结合很弱，但与任何其他hFcR的结合都检测不到。单体IgG2没有与任何hFcR结合。单体IgG3仅与FcRI和FcRIIIA结合。它们与FcRIIIA-V158的结合优于与FcRIIIA-F158的结合。单体IgG4只与FcRI结合（图1B）。因此，FcRI是IgG1、IgG3和IgG4的高亲和力受体；而FcRIIIA-V158仅是IgG3的高亲和力受体。

        在低浓度下（0.3 g/mL IgG），IgG1-F2 IC与所有hFcRs结合，除了FcRIIB、FcRIIC和FcRIIIAF158。它们确实与FcRIIIA-V158结合，但不与FcRIIIA-F158结合。它们与FcRIIA-R131和H131的结合情况类似。它们与FcRIIIB-NA1、NA2或SH的结合也很相似。它们与FcγRIIIB-NA1、NA2或SH的结合也很相似（图2A）。IgG2-Fγ2 IC仅与FcγRIIAH131结合。IgG3-Fγ2 IC与所有hFcγR的结合程度相当，但与FcγRIIB和FcγRIIC的结合效率较低。这种差异在更低浓度的IgG（0.1?g/mL；数据未显示）下更加明显。它们与FcγRIIAR131和H131的结合相似，与FcγRIIIAF158和V158相似，与FcγRIIIBNA1、NA2或SH相似。IgG4-Fγ2 IC仅与FcγRI结合。

       在高浓度下（10 ug/mL），IgG1-Fcγ2 IC与所有hFcγR结合，但与FcγRIIB和FcγRIIC结合的效率较低（图2B）。IgG2-F2 IC与FcRIIA-H131，以及FcRIIA-R131和FcRIIIA-V158结合，尽管效率较低。即使在较高的浓度下（30g/mL；数据未显示），它们也不能检测到与其他hFcR结合。没有测试高浓度的IgG3-F2 IC，因为它们的结合超过了检测范围。IgG4-F2 IC不仅与FcRI结合，而且还与FcRIIA、B和C以及FcRIIIA-V158结合。它们与FcRIIA-R131的结合优于与FcRIIA-H131的结合。它们既不能检测到与FcRIIIA-F158的结合，也不能检测到与FcRIIIB-NA1、NA2和SH的结合，即使在较高的浓度下（30g/mL；数据未显示）。总的来说，这些结果表明，所有4种IgG亚类都与hFcR结合。IgG1和IgG3，而不是IgG2和IgG4，与所有的hFcRs结合（总结在图2C）。值得注意的是，IgG2不仅与FcRIIA-H131结合，前人研究表明，还与FcRIIA-R131和FcRIIIA-V158结合。IgG与FcRIIB和FcRIIC的结合效率低于任何其他hFcR。FcRIIA的H131R突变减少了IgG2的结合，增加了IgG4的结合。FcRIIIA中的V158F突变减少了IgG1的结合，废除了IgG2和IgG4的结合。FcRIIIB多态性不影响IgG的结合。

FcR亚类对人IgG结合的影响

        意外的是，单体IgG3可以与低亲和力的FcRIIIA-V158结合。因此，该受体可以作为一种高亲和力（affinity）的FcR。以前发现FcRIIIA对小鼠IgG2a有中等的亲和力，与其他低亲和力的hFcRs相比，这种较高的亲和力被认为是依赖于它与FcR的结合。To investigate whether this might apply to human IgG, we generated a chimeric FcRIIIA-V158 whose expression would not require FcR by replacing its transmembrane and intracellular domains by those of FcRIIB (FcRIIIA-V158(EC)-IIB(TM IC)).在表达类似水平的FLAG标记的人FcRIIIA-V158或FcRIIIA-V158（EC）-IIB（TM IC）的CHO细胞系上研究了人多克隆IgG的结合。单体IgG1（图S2）、单体IgG2和单体IgG4（未显示）没有与这些细胞结合。Monomeric IgG3 bound similarly to both transfectants。作者分析了模拟IgG IC的热聚集IgG的行为，这些IgG已被用于许多FcR结合和FcR激活试验。热聚集的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或IgG1-F2 IC和IgG3-F2 IC与两种表达FC受体的CHO的结合情况类似。因此，独立于FcR表达的FcRIIIA对人类IgG有正常的亲和力。

hFcRs与IgG亚类的结合亲和力

        为了测量hFcRs对4种IgG亚类的亲和力，在HEK-293T细胞中产生了所有FcRII和FcRIII及其多态变体的FLAG标记的胞外结构。FcRIIB和FcRIIC的胞外结构是相同的，因此生产了一个胞外结构，在此称为FcRIIB/C，以分析对FcRIIB和FcRIIC的亲和力。使用了多组氨酸标记的FcRI胞外结构，而不是其没有功能的FLAG标记的对等物（FLAG-tagged equivalents）。N-糖苷酶F处理前后的SDS-PAGE分析表明，这些分子是N-糖基化的（数据未显示）。它们被共价固定在活化的葡聚糖表面，用于表面等离子体共振（SPR）分析（图3A）。

        IgG1以较宽的亲和力与hFcR胞外区结合。它们与FcRIIB/C和FcRIIIB-NA1、NA2或SH结合的Ka是2X10^5 M-1，与FcRIIIA-V158或F158结合的Ka是1.5X10^6 M-1，与FcRIIA-H131或R131结合的Ka是4X10^6 M-1，与FcRI结合的KA约为6.5X10^7 M-1（图3A，B）。

        IgG2与hFcR外显子结合的亲和力范围同样很广。它们与FcRIIAR131和FcRIIIAV158结合的Ka约为8X10^4 M-1。它们与FcRIIA-H131（KA=4.5X10^5 M-1）的亲和力较高，与FcRIIIAF158和FcRIIB/C（KA约2.5X10^4 M-1）的亲和力较低。它们对FcRI或FcRIIIBNA1、NA2或SH没有可检测的亲和力（图3A,B）。

        IgG3也与hFcR结合并且具有广泛的亲和力。它们与FcRIIAH131或R131以及FcRIIIB-NA1、NA2或SH结合，其KA值约为1X10^6 M-1。它们与FcRIIIA-V158或F158的亲和力较高（KA值约为5X10^6 M-1），与FcRI的亲和力较高（KA值约为6.1X10^7 M-1），而与FcRIIB/C的亲和力明显较低（KA 1.7X10^5 M-1）（图3A,B）。

       IgG4与hFcRII/III外显子的结合亲和力范围很窄。它们与FcRIIA-H131或R131、FcRIIB/C和FcRIIIA-V158或F158结合，KA约为2X10^5 M-1。它们与FcRI结合的亲和力更高（KA约为3.4X 10^7 M-1）。它们对FcRIIIB-NA1、NA2或SH没能检测到亲和力（图3A,B）。

       SPR分析数据显示，人IgG与低亲和力hFcRs的相互作用分为两组：一半的亲和力约为1至10^5 M-1，一半的亲和力为1至10^6 M-1。值得注意的是，FcRIIB/C对所有4种IgG亚类的亲和力都是最低的。FcRIIA对IgG1的亲和力比FcRIIB/C高35倍。同样，FcRIIIA对IgG3的亲和力比FcRIIIB高5倍。R131H多态性影响FcRIIA对IgG2的亲和力，但几乎不影响其对IgG1、IgG3和IgG4的亲和力。F158V多态性适度增加了FcRIIIA对所有4个亚类的亲和力。NA1/NA2/SH多态性并不影响FcRIIIB对任何IgG亚类的亲和力。正如预期的那样，FcRI对IgG1、IgG3和IgG4有最高的亲和力，但对IgG2没有亲和力。SPR分析还揭示了IgG2与FcRIIB/C和FcRIIIA-F158以及IgG4与FcRIIIA-F158的可测量的相互作用，这一点在免疫荧光分析中没有检测到。

hFcRs对单克隆IgG的结合特异性

          为了确定hFcRs对人单克隆和人多克隆IgG的特异性是否相同，作者首先检查了具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc部分的小鼠/人嵌合抗NiP抗体与图1中同一组CHO的结合。用NiP-BSA（IgG-Ag IC；图S3A）或用F(ab)2抗人F(ab)2（IgG-F2 IC；图4A）制作使用的IC。所有hFcγRs与IgG-Fγ2 IC的荧光强度均高于IgG-Ag IC。用单克隆IgG1、IgG3和IgG4制成的IC对所有hFcRs，包括多态变体，分别显示出与多克隆IgG1、IgG3和IgG4相同的结合特异性。IgG1、IgG3和IgG4单克隆抗体与IgG1、IgG3和IgG4多克隆抗体对所有hFcRs具有相同的结合特异性(包括多态变异)。单克隆IgG2与多克隆IgG2结合方式相似，除了IgG2- Ag IC与FcRIIB/C和FcRIIIA-F158结合弱外(图4A和图S3A)。有趣的是，通过SPR分析可以检测到这2种受体对IgG2多克隆的弱亲和力(图3A,B)。然而，当热聚集或与F(ab)2抗人F(ab)2复合物时，一种人源骨髓瘤IgG2抗体与FcRIIIA-V158和F158具有相似的亲和力(图4B)。mAbs越来越多地被用于治疗人类疾病，如淋巴瘤（抗CD20或抗HLA-DR）、过敏性哮喘（抗IgE）或新生儿溶血性疾病（抗RhD）。大多数治疗性mAbs是嵌合的小鼠/人类或全人类IgG1 Abs。这些单克隆抗体所涉及的hFcRs大部分仍是未知的。因此，作者研究了由1个完整的人IgG1抗rhd mAb和2个嵌合的小鼠/人IgG1(抗cd2042和抗HLA-DR)制备的IgG-F2 IC与图1所示的同一组CHO的结合，并测量了抗cd20和抗RhD对hFcRs胞外结构域的亲和性。所有3种mAbs都与所有hFcRs（图S3B）结合，具有可测量的亲和力（表1，CHO列）。然而，FcRIIB和FcRIIC需要较高浓度的复合物，它们对抗CD20和抗RhD的亲和力低于其他hFcRs（图5）。值得注意的是，SPR研究的2种单抗的亲和力变化高达4倍。FcRIIIB多态性对结合没有明显影响。FcRIIA-H131和FcRIIIA-V158对抗cd20和抗rhd的亲和力分别高于FcRIIA-R131和FcRIIIA-F158。

Figure S3. Binding specificity of hFcγRs for monoclonal IgG (JPG, 152 KB). (A) Histograms show the binding of anti-FLAG mAb (─) or its isotype control (▬), and the binding of immune complexes made of biotinylated NIP12-BSA and anti-NIP mAbs subclasses to FLAG-tagged hFcγRs on CHO transfectants. Concentrations of human IgG and NIP12-BSA are indicated. (B) Binding specificity of low-dose therapeutic monoclonal IgG1-F′2 IC to hFcγRs. Histograms show the binding of anti-FLAG mAb (─) or its isotype control (▬), and the binding of indicated monoclonal IgG1-F′2 IC to FLAG-tagged hFcγRs on CHO transfectants. Concentrations of monoclonal IgG and PE-F(ab′)2 anti-human Ig are indicated. Monoclonal IgG1 used here were produced in CHO cells. Solid grey histograms represent the binding of PE-F(ab′)2 anti-human Ig alone. Two independent experiments gave similar results.

mAb的岩藻糖基化对其对hFcγRs的亲和力的影响

抗体的糖基化决定了它们与FcRs结合的能力，糖基化变体已经产生，目的是提高其治疗效果。因此，作者测量了在YB2/0细胞中产生的低岩藻糖基化的抗CD20和抗RhD mAbs与hFcRγ的亲和力，并与在1,6-岩藻糖基转移酶有效的CHO细胞中产生的相同mAbs与hFcRγ的亲和力进行比较（表1）。岩藻糖基化既不影响2种mAbs对FcRIIA和FcRIIB/C的亲和力，也不影响它们对FcRIIIA-V158比对FcRIIIA-F158的亲和力。岩藻糖基化降低了两种mAbs对FcRIIIA的亲和力，降低了抗RhD对FcRIIIB的亲和力，而不是抗CD20。因此，岩藻糖基化可能影响IgG1 mAbs对FcRIII的亲和力，而不是对FcRII。