文献下载链接 A new protocol for single-cell RNA-seq reveals stochastic gene expression during lag phase in budding yeast
发表期刊：《eLife》
影响因子：8
时间：2020年
0. 文章内容总结
现有的单细胞转录组测序技术大多应用于哺乳动物细胞，本篇文章的作者对10x genomics液滴包裹的单细胞转录组测序方法进行改造，使其适用于酵母细胞。并在此方法基础上，验证了酵母群体应对碳源转变（从葡萄糖转移到麦芽糖）的响应动态：
（1） 这种转变导致细胞群中强烈的异质反应，单个细胞需要适应新碳源的时间（滞后时间）从5小时到20小时不等；
（2）在观察到的24小时时间窗内，部分细胞在转向麦芽糖后从不恢复生长。
结论：揭示了酵母细胞之间的异质性以及潜在的分子过程。
酿酒酵母：AN63（来自于BY4742）
试剂类型： Chromium Single Cell 3' kit (v2)
单细胞数据：GSE144820
取样类型 glucose-6h glucose-12h lag-1h lag-3h 混合样本 细胞数 1695 1096 1172 1469 686 中值UMI 1261 894 528 607 975
1. 细胞裂解方法研究
裂解细胞壁的酶： 藤黄节杆菌酶
模拟10x单细胞转录组的过程：细胞在冰上保持25min，然后转入室温6min，最后放入53摄氏度45min（模拟细胞裂解和逆转录步骤）。使用自动细胞计数器监测整个过程的细胞数目。
40min后几乎检测不到细胞
设置了对照组实验，验证藤黄节杆菌酶裂解细胞壁，而非高温引起的
添加PBS对照组
2. 方案设计
实验处理：酵母在麦芽糖中预生长一段时间，然后转入葡萄糖中生长12h，最后再转入麦芽糖中
实验取样：转入葡萄糖后6h，转入葡萄糖后12h，停滞期1h，停滞期3h，麦芽糖和葡萄糖12h分别取样（1：1混合）
实验设置
由于在麦芽糖上生长的细胞与在葡萄糖上生长的细胞表现出明显不同的生理和基因表达模式，作者期望在对照样本中看到两个清晰的亚组，用来验证该方案是否能有效实现单细胞水平的转录定量。
实验设计
3. 可行性验证
3.1 与bulk RNA-seq做对比
作者之前有做过glucose-12h的转录组测序《Transition between fermentation and respiration determines history-dependent behavior in fluctuating carbon sources》， DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.39234，使用这里的数据与本篇文章的scRNA-seq数据做对比。
- 单细胞转录组数据：取每个基因的UMI总和，并取其对数值
- 转录组数据：取每个基因的FPKM的对数值
（1）RNA-seq精确度更高：scRNA-seq检出的基因表达水平较低（r平方相关性0.701）
（2）scRNA-seq可以检测到群体中的低表达gene：42个基因的表达只在scRNA-seq中被检出，同时检测到的表达量偏低
（3）scRNA-seq有drop-out的情况：280个基因的只在RNA-seq中被检出，并表现出较高的表达
bulk RNA-seq 与 scRNA-seq比对分析
3.2 灵敏度和批次效应检测
这里在寻找marker基因做细胞注释的时候出现了困难：酵母在葡萄糖培养基生长时表达的基因也会在麦芽糖培养基中表达，因此作者只用在麦芽糖培养基生长的基因来做marker区分两者。
3.2.1 细胞分群明显
混合样本可以通过sc-RNAseq明显分为两个group： 在麦芽糖培养基生长相关的基因（MAL11、MAL12、MAL31、MAL33、IMA1、HXK1）仅在左边的亚群表达
麦芽糖生长的细胞呈现红色
3.2.1 批次效应低
作者分析了glucose-12h和混合样本，批次效应是明显小于细胞所表现出的生理效应的。
混合样本分两个群，葡萄糖对照组能明显映射到混合样本的同类细胞
4. 酵母单细胞数据分析
作者确认该方法能够准确地解决异质性表达后，便进一步研究了酵母群体从葡萄糖到麦芽糖培养基转变过程中的转录异质性。该团队2018年的文章就报道过：
（1）在一个混合良好、同质的群体中，等基因细胞之间的滞后期的持续时间差异很大。
（2）细胞可以分为两大类：一组能够恢复生长（经过2-50小时滞后时间），另一组细胞则不能进行切换。
（3）呼吸蛋白和麦芽糖分解代谢蛋白(MAL基因)在恢复生长的部分细胞中被诱导
疑问：异质性的分子来源尚不清楚。例如，没有发现细胞的复制寿命、特定分解代谢蛋白与细胞滞后期特性之间的相关性
从图中可以看到：酵母从葡萄糖转到麦芽糖之后进入一个生长停滞期，需要适应新的碳源后才可以恢复生长。
4.1 细胞分群
通过UMAP作图发现，glucose-6h 和 glucose-12h没有明显的分群，而lag-1h、lag-3h都有明显区分开。因此作者在这里单独将此三个数据的细胞做图如下，同时提示大家lag-3h还可以亚群细分进一步挖掘。
所有样本数据一起分析
注意哦，这是3个不同取样点的酵母测序数据混合在一起做出来的图（3个取样点分别上机，构建了3个单细胞测序文库）
不同阶段的细胞分群
4.2 亚群细分
使用Seurat包的FindClusters功能，将数据分为4个群（lag-3h被分为2个群）。
对比cluster 3和 cluster4，作者发现 cluster4 电子传递链复合物的几个基因的过表达与之前（2018年的文章）的观察一致，提示呼吸作用的激活是逃避滞后期的关键早期步骤，同时应激反应基因和高亲和己糖转运体也在cluster4高表达：
- cluster 4（生长期细胞）：628个基因过表达（氧化还原过程，前体代谢产物和能量的产生）
- cluster 3（非生长期细胞）：374个基因过表达（翻译和多肽的生物合成过程）
，即呼吸作用的激活（诱导产生ATP来应对碳源转换）是逃避滞后阶段的关键早期步骤
亚群细分
4.3 单细胞蛋白的测量证实了scRNA-seq的发现
作者从单细胞蛋白水平定量分析
-
Qcr7：电子传递链复合物III的一个亚基
-
Ssa1：应激反应蛋白
-
Hsp12：应激反应蛋白
-
Hxt2：高亲和性己糖转运体
-
Hxt7：高亲和性己糖转运体
单细胞蛋白水平的定量
4.4 基因共表达分析（glucose-12h）
作者继续研究在转向麦芽糖之前，能否观察到群体中的表达异质性。
通过关联群体内所有细胞的标准化表达水平，确定了glucose-12h样本中的共表达基因组如下图。
- 通过R包中的k-means聚类方法将共相关基因群聚类在一起 ，同时将基因群设置为6个（based on visual inspection）
- 基因表达UMI≥10
- 相关基因个数≥7
- 最小Pearson coefficienct值为0.1
- Bonferroni校正的相关p-value阈值为0.05
高表达的基因集合
-
cluster 6：核糖体蛋白编码基因
-
cluster 2：包括8个核心组蛋白基因
-
cluster 5：胁迫相关基因、麦角甾醇生物合成基因、铁代谢基因（与cluster6中的核糖体基因表达呈负相关）
低表达的基因集合
- cluster1：应激和热休克基因、三羧酸循环中的关键基因、高亲和力的己糖转运体
备注：分析发现Msn2或Msn4转录因子调控了cluster 1中的151个成员基因中的91个。这两种转录因子都通过随机核定位在随机基因表达中发挥关键作用，并在环境变化过程中的生存中发挥作用。
因此作者认为： cluster1表现出了一种可变随机的表达模式。表达这些基因的细胞可能在某些环境挑战中具有优势，可能包括向另一种碳源的过渡。同时这些数据与作者之前的研究结果一致，表明三羧酸循环和呼吸的激活对于从葡萄糖向其他碳源的有效转变至关重要。
glucose-12h
4.5 基因共表达分析（lag-3h、lag-1h）
作者对lag-3h和lag-1h的样本进行了类似的共表达分析。如下图
cluster 3 （核糖体基因）在glucose中显著高表达，但在lag-1h和lag-3h中表达降低。这种核糖体基因转录的缺失与滞后期的生长停止相一致，似乎这些基因的表达水平之间的相关性反映了细胞进入滞后阶段的细胞周期阶段。
cluster2 （应激，修复相关基因）中包含了碳源转换后被诱导的基因，可能表明这些基因的诱导和共表达发生在恢复生长的细胞中。
lag-3h
lag-1h
后续作者将这些基因与 resume growth cells(4.3-恢复生长的细胞)所表达基因做对比
- cluster 2 的481个gene都在resume growth cells中表达
- glucose-12h中cluster1的基因（63/151）也在resume growth cells中表达。
因此作者下定结论：一组在葡萄糖生长过程中受到抑制的基因，表现出stochastic leaky expression，在葡萄糖向麦芽糖转移后，resume growth cells对此解除了抑制。
5. 假设和验证
5.1 遗传谱系相同的酵母表现出相似的性状
以上的观察表明，在葡萄糖中生长的细胞表现出某些基因的异质表达，这些差异可能会影响它们在碳源转换时，恢复生长的能力。因此作者猜想，对于谱系相关的细胞，例如最近脱离母细胞的子细胞，可能会显示出相似的滞后时间，因为这些细胞具有相似的染色质状态或某种蛋白质或其他随机波动因子的相似浓度。
作者设置了以下实验，比较群体中细胞谱系（即与同一单母细胞相连的不同子细胞）的滞后时间：
细胞在葡萄糖中培养8小时，然后将单细胞困在CellAsic微流体室中，在葡萄糖培养基中培养1小时，然后将培养基转移到麦芽糖中。在葡萄糖上生长的过程中，被捕获的单细胞分裂并形成2到4个细胞的微菌落（即1到两个细胞分裂）。如果转移的结果为随机的，那么在同一微菌落内细胞的滞后时间和其他细胞相比应该没有太大差别。获得了以下图。
但是图C的结果表明，系谱相关的细胞具有至少几个小时稳定的因素，并且细胞转移到麦芽糖后的命运受到这些因素的影响。
图A
图B
图C
为了排除这种观察结果可能是微流体室中介质不均匀流动的人为影响，影响不同的微菌落，我们测量了来自膜透性阳离子荧光染料(JC10）的细胞内信号。基于作者开发的机器学习自动图像分析管道，用于测量单个细胞的细胞内荧光信号，并从细胞外周减去背景信号。
JC10 胞内信号
作者最终观察到，一旦含有染料的培养基开始流动，细胞内的信号就会迅速而均匀地增加，所有的微菌落都表现出类似的反应，这表明到达所有细胞的培养基分布良好。因此排除了介质不均匀流动造成的差异。
背景噪音分析
5.2 持续的ATP生成与滞后期细胞的命运有关
scRNA-seq结果表明，决定细胞逃脱停滞期效率的一个潜在重要因素，是细胞转移之前细胞内部ATP的浓度。当细胞从葡萄糖转移到麦芽糖时，葡萄糖不再输入到细胞，因此细胞不能产生ATP，除非它们开始激活麦芽糖输入的通路或使用其他方式产生能量，例如通过分解储存的碳水化合物。.
作者假设，当ATP水平低于临界值时，会使细胞无法适应新的条件，特别是如果他们后期仍然无法通过其他途径恢复ATP水平，例如通过摄取微量的葡萄糖和/或激活更有效的呼吸代谢。
因此作者测量了活的单细胞在葡萄糖向麦芽糖转移过程中的ATP水平。
使用ATeam的基因组集成盒（这是一种基于fret的传感器，用于ATP测量）
单细胞内ATP的变化
正如假设的那样，我们观察到在向麦芽糖转移后不久，ATP水平急剧下降，这与生长停滞相一致。大多数细胞在向麦芽糖转移后的6小时内恢复了正常的细胞内ATP水平。值得注意的是，只有最终恢复生长的细胞才能在滞后期恢复和维持正常的ATP水平，而在不能恢复生长的细胞中，ATP水平不能完全恢复，或者在暂时增加后迅速下降。
总之，这些结果表明，在向麦芽糖转移后，生长停滞与ATP水平的急剧下降相一致，只有能够以可持续的方式再生ATP的细胞才能在麦芽糖中恢复生长。然而，重要的是，我们没有观察到在转移之前细胞内部ATP含量的差异。这表明，虽然ATP含量的维持和恢复与有效地逃避滞后期有关，但它可能不是细胞间异质性的主要驱动因素。相反，与葡萄糖运输、抗压力和/或呼吸相关的基因表达的随机差异很可能是观察到的表型差异的真正驱动因素。
这种高通量的方法相比于SMART-seq方法
- 优势：提高了细胞通量，有助于发现和分析稀有细胞
- 劣势：降低了mRNA捕获效率
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