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Single-cell RNA-seq reveals early heterogeneity during ageing in yeast
发表期刊：《Cell Reports》
影响因子：9.4
时间：2020年
1. 背景
芽殖酿酒酵母具有有限的分裂潜能，在死亡之前只能产生有限数量的子细胞，这种现象被称为 复制衰老，而在死亡前产生的子细胞的数量被称为 复制寿命（RLS）。由于酿酒酵母的寿命较短；生物学背景清晰；基因编辑方法简单，因此被认为是研究衰老的理想模式生物。事实上，最初在酿酒酵母中发现的衰老基因，以及衰老相关的信号通路都十分保守，并相继在线虫、分枝杆菌甚至人类中发现。
传统的衰老细胞分选方法：磁珠分选，算法分析，往往不能区分活的老细胞和死亡的细胞。
使用单细胞转录组测序方法来研究酵母的衰老，同时定量评估不同酵母细胞之间的异质性。相对于传统的方法（纯化大量的衰老细胞用来做bulk RNA-seq），能够为衰老研究带来更精确的见解。
酵母细胞的分裂时间与RLS呈负相关
2. 试验方案
2.1 衰老过程中单个酵母细胞的分离和scRNA测序
通过在固体琼脂板上持续进行人工显微解剖，构建一个 RLS阵列（在3个不同的时间点采样：新生后2hr，16hr，32hr），细胞分别放置到单管（包含细胞裂解液和ERCC）进行单细胞转录组测序（Smart-seq2）。
酵母老化过程中scRNA-seq的工作流程示意图：出生2h、16h、32h的酵母细胞（椭圆形的虚线标记）通过人工显微解剖的方式分离后，分别放入预置裂解缓冲液的单管中，进一步执行优化的smart-seq2实验步骤以及后续分析步骤
2.2 数据质控
作者通过分析前人的单细胞酵母成像数据：（图表在补充文件）
（1）酵母的早期分裂动力学与细胞的复制寿命有关：发现在第8小时已经出现了代系分布差异，同时在12 hr 和 16 hr的数据显示差异程度进一步增加。
（2）HSP104（编码维持蛋白酶抑制的肽链分子装配陪伴蛋白）的表达水平与RLS负相关：HSP104基因表达水平由 GFP tag体现。
基于此展开以下实验
作者总计收集了136个酵母细胞，测序分析后剔除不合格的细胞（低基因表达的细胞；有效reads占比偏低的细胞），最终用于分析的细胞125个（3个时间段分别为：37，43，45），中值gene高达2202。
3. 结果分析
3.1 酵母菌衰老过程中细胞间的转录变异性
通过3个不同年龄组的酵母单细胞转录组数据分析可以看出，细胞与细胞之间的转录异质性随着酵母群体衰老而增加。
图b：x轴为3个不同年龄组的酵母；y轴为基于转录（mRNA/ERCC）水平相关性分析的转录变异值；上边框和下边框分别表示第一和第三个四分位数；中位线用黑色粗线表示；胡须表示在四分位数1.5倍范围内的值；P-value值显示在箱线图上方。 图c：3个不同采样时间的PCA分群图（n=125）；36-hr采样的酵母离散程度更高。图d：3个不同年龄组的拟时序分析图（n=125）；没有包含细胞周期相关的基因；随着采样时间的延长，细胞的离散程度增加
作者通过一种定量分析方法验证了不同酵母细胞之间的转录异质性，并在每个组中分别观察到145，312，524个高度可变基因（HVGs）。通过 DAVID进行GO富集分析，细胞的铁离子稳态和铁载体运输在16-hr组显著富集，预示着在酵母衰老过程中存在铁离子运输的早期异质性。（相关图表在补充材料）
3个年龄组中分别有19.3%，12.8%，15.5%的HVGs被认为是调控细胞周期的基因。为了排除细胞周期基因的影响，作者将他们去除后重新分析发现，细胞之间的转录异质性随群体衰老而增大的趋势仍然存在。（相关图表在补充材料）作者进一步通过PCA作图分析（图c+补充材料），无论细胞周期调控基因是否存在，都不影响转录异质性在细胞间逐渐增大的趋势。
3.2 酵母菌衰老过程中的整体差异基因表达
单细胞转录组分析显示了关键的生物过程或细胞成分，包括氧化还原过程、氧化应激反应（OSR）、翻译、核糖体生物发生和线粒体，它们是酵母衰老的基础。
图e：标准化基因表达热图；36-hr与 2-hr相比存在551个高表达基因和138个低表达基因；紫色的bar代表在36-hr年龄组高度表达的145个线粒体相关基因；右侧柱状图为GO富集分析中BP模块显著上和下调的基因。图f：标准化基因表达的框线图（针对图e中显著上调和下调的基因集合）；每一个黑点代表一个细胞； **p < 5.5 x 10 ^-7
, ***p < 4.2 x 10 ^-9, ****p < 1.6 x 10 ^-13
作者使用DESeq研究不同年龄组之间的差异表达基因，很明显36-hr 和 2-hr相比较时差异表达基因最多。通过DAVID进行GO富集分析：与氧化还原和氧化应激相关的生物过程在36-hr 年龄组显著富集，而翻译、核糖体发生相关的生物过程在2-hr年龄组显著富集。此外，GO富集的生物组成中，将近30%（145/551）的高表达基因（36-hr相对于2-hr）在线粒体中富集。
不同年龄组的平均标准化基因表达水平进一步表明，氧化还原、OSR和线粒体相关基因呈年龄依赖性增加，翻译和核糖体生物发生相关基因的表达随年龄增加而减少(图1f)。
3.3 酵母菌衰老过程中的加权基因共表达网络分析
进一步验证上面的结论：酵母的衰老伴随着氧化应激反应（OSR）、氧化还原过程、核糖体生物发生的相关基因表达的变化。
图a：利用WGCNA构建的基因共表达网络图；每个树枝代表一个基因，树状图下不同的颜色表示不同的Module，灰色为识别过程中无法分配到初级模块中的基因，数分枝尖端为核心基因。图b：模块性状关系图；如果模块在样品中特征值正或负表达较高，说明该模块与这个样品密切相关；数字表示相关性系数；括号内的数值代表P-value值。图c和d：x轴代表不同基因，y轴代表不同细胞，样本分组以3中不同颜色bar标记；热图和柱状图显示衰老酵母中turquoise module显著上调，而blue module显著下调
作者为了寻找酵母衰老过程中高度相关的基因簇，进行了加权基因共表达网络分析(WGCNA)，生成了7个不同的基因共表达模块(图2a；见方法)。通过这些基因的共表达模块，作者从正相关模块的731个基因中鉴定了52个核心基因，这些基因主要在OSR和氧化还原过程中富集，其中5个甚至参与了长寿调节途径，其中便包括HSP104（酵母衰老的分子标志物）。作者从负相关模块的410个基因中鉴定了70个核心基因，这些基因的表达主要随着衰老而降低，主要与核糖体生物发生有关。
3.4 慢分裂和快分裂年龄亚组之间的基因表达差异
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细胞中的基因检出量与细胞繁殖代数正相关，快分裂亚组基因表达量更高
图a左：16-hr early age group中基因检出量与细胞繁殖代数之间的关系；红色的点代表一个细胞，横坐标为细胞在16-hr的代数，纵坐标为细胞的基因检出率，蓝线代表灰色区域（0.95的置信区间）的拟合曲线。图a右：箱线图中间的横线为16-hr细胞的平均代数，可以看到基因检出量与细胞繁殖代数之间呈现正相关。图b左：36-hr early age group中基因检出量与细胞繁殖代数之间的关系；红色的点代表一个细胞，横坐标为细胞在36-hr的代数，纵坐标为细胞的基因检出率，蓝线代表灰色区域（0.95的置信区间）的拟合曲线。图b右：箱线图中间的横线为36-hr细胞的平均代数，可以看到基因检出量与细胞繁殖代数之间呈现正相关。注意：基因检出量低于1000的细胞都在后续分析中丢掉。
细胞中的基因检出量与细胞繁殖代数有关，作者将16-hr和36-hr年龄组分别划分为慢分裂亚组（16-hr/S、36-hr/S）和快分裂亚组（16-hr/F、36-hr/F）。
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酵母铁专运载体相关基因（FIT3、HAC1）的表达可以定量表明酵母衰老过程中的早期异质性，它在慢分裂组中的高表达可能与线粒体DNA丢失有关。
图c：热图展示了16-hr/S与16-hr/F中显著高表达和低表达基因在不同年龄分组中的基因表达差异。图d：不同年龄组中 FIT3、HAC1以及线粒体相关的11个基因的标准化基因表达散点图，一个点代表一个细胞。图e：不同年龄亚组中FIT3、HAC1以及线粒体相关的11个基因的标准化基因表达散点图，一个点代表一个细胞。
FIT3、FIT2 和 FIT1的高表达通常由铁缺失或线粒体DNA丢失诱导。16hr/S、36hr/S中低表达的24个基因中有11个在线粒体中富集，进一步表明慢分裂细胞中的线粒体功能相对较差。通过 DESeq2对比16-hr的两个亚组获得29个差异表达基因，5个在16-hr/S中高表达，24个在16-hr/S中低表达。其中FIT3 （与 FIT2 和 FIT1共同编码酵母细胞壁甘露糖蛋白，作为酵母铁运输载体）和 HAC1在16-hr/S亚组高表达，HAC1是调控UPR的一种转录因子，FIT3便是其中的一个靶点。除此之外，FIT3 和 HAC同样在36-hr/S亚组高表达。
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FIT3 可以作为酵母衰老早期异质性的生物标志物，用来预测寿命：FIT3基因的表达与细胞的繁殖代数呈负相关，单基因缺失可以延长酵母的寿命。
图f左：FIT3基因表达量与16-hr 细胞繁殖代数的关系；红色的点代表一个细胞，横坐标为细胞在16-hr的代数，纵坐标为FIT3的基因表达量，蓝线代表灰色区域（0.95的置信区间）的拟合曲线。图f右：FIT3基因表达量与36-hr 细胞繁殖代数的关系；红色的点代表一个细胞，横坐标为细胞在36-hr的代数，纵坐标为FIT3的基因表达量，蓝线代表灰色区域（0.95的置信区间）的拟合曲线。图g：WT与FIT3敲除株系的生存曲线（括号内的数字代表平均复制寿命，n=40表示参与数据统计的细胞数目）
本次实验发现了FIT3基因的表达与细胞的繁殖代数呈负相关，之前便有报道FIT2和FIT3的基因敲除可以延长酵母的寿命，因此作者使用FIT3敲除酵母和WT酵母绘制生长曲线，再次验证了此结论。
3.5 转录因子(TF)在年龄亚组间的时间调控
- 通过酵母老化过程中TFs的独特时间调节揭示了早期和晚期异质性：YAP1对OSR和RPN4对蛋白酶体活性的调控在年龄亚组间存在差异
图a：16-hr/F相对于16-hr/S转录因子靶点差异表达(5个)的热图以及晚期36-hr/F相对于36-hr/S转录因子靶点差异表达(2个)的热图
图b和图c：16-hr/F与16-hr/S对比，YAP1的靶向集合在16-hr/F高表达；36-hr/F与36-hr/S对比，RPN4的两个靶向集合在36-hr/F高表达
作者首先对比了不同年龄亚组间的median TF target expressions，获得 16 TF targets在16-hr/F显著激活，11 TF targets在36-hr/F显著激活（在补充材料）。对此获得的TF靶向基因做热图分析（标准化基因表达），最终在16-hr/F获得5个显著激活的TF targets（其中YAP1在调节早期年龄亚组中的活性最为显著），在36-hr/F获得2个显著激活的TF targets。YAP1参与激活抗氧化基因的转录，以应对氧化应激，在16-hr/F亚组中，YAP1 靶点的相对较高的激活表明，快速分裂的单细胞倾向于长寿，可能比缓慢分裂的细胞有更好的氧化应激防御系统。RPN4是一种刺激蛋白酶体发生（降解受损蛋白）的转录因子，36-hr/F亚组中明显可以看出其表达水平的升高对于RLS的增加至关重要。
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