完整的实验离不开后续的验证。话不多说，接下来我们就细数一下MeRIP-seq，都有哪些相关的验证实验吧~
一、m6A区域验证
首先，如果需要对m6A修饰位点进行严格的验证，可以用下面这个方法：
1、m6A-IP-qPCR
m6A-IP-qPCR，也叫MeRIP-qPCR，即m6A抗体富集到带甲基化修饰的RNA，下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。
二、m6A相关蛋白结合验证
m6A修饰的过程，离不开甲基转移酶（writer）、去甲基转移酶（eraser）和阅读蛋白（reader）的作用。如下图，展示了与m6A修饰作用相关的各种RNA结合蛋白：
所以，RNA-蛋白质、蛋白-蛋白互作，也是MeRIP-seq后续实验验证关注点，那么让我们看看验证RNA与蛋白以及蛋白质之间相互作用的实验有哪些吧~
2、RIP
主要是用来研究体内RNA与蛋白结合情况。比如，检测reader蛋白与RNA的具体结合情况。
该方法具体是利用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，通过分离纯化，对结合在复合物上的RNA 进行RT-PCR验证或测序分析，了解转录后调控网络动态过程。
（METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma. Molecular cancer, 2019）
3、Pull down
- RNA Pulldown
研究RNA与蛋白质互作的一种技术。利用生物素标记的RNA探针，通过与含有目的蛋白的溶液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。复合物可以特异性结合磁珠，从而与孵育液中的其他蛋白分离。复合物洗脱后，通过蛋白凝胶电泳实验，检测特定的RNA与蛋白的结合情况。
（METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma. Molecular cancer, 2019）
- GST Pulldown
体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
该实验基于GST（glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白，可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合。
将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合，若环境中存在与X蛋白互做的蛋白Y，则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物，与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。
（Sec62 promotes stemness and chemoresistance of human colorectal cancer through activating Wnt/β-catenin pathway. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research . 2021）
4、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质A（图中红色方块）的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B（图中黑色方块）也能沉淀下来。若B为已知蛋白，用WB验证A和B互作；若B为未知蛋白，用质谱可知与A互作的蛋白。
（METTL14 regulates M6A methylation-modified primary miR-19a to promote cardiovascular endothelial cell proliferation and invasion. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2020）
三、m6A功能验证
5、Ribo-seq检测mRNA 翻译效率
已知m6A修饰会影响RNA的翻译效率。Ribosome profiling sequencing（Ribo-seq)），是针对核糖体结合的RNA进行测序。
该方法富集与核糖体结合的正在翻译的RNA，然后通过测序对富集的RNA进行定量，从而实现对翻译强度进行定量。
（1、N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 2015 Jun；
2、Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2018 July ）
6、mRNA Stability 半衰期检测
检测RNA半衰期的方法有很多。比如，可以利用转录抑制剂放线菌素D抑制细胞内基因转录后，在不同时间点收集总RNA，然后做Northern或者RT-PCR，比较不同时间点mRNA丰度的变化。如下图，Boxuan Simen Zhao.在“Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications”一文中通过半衰期讲述m6A修饰对mRNA稳定性的影响。
四、m6A相关蛋白的功能验证
除了一系列的分子生物学上的验证，当然也少不了细胞水平和动物模型方面的实验，接下来也顺便简单了解一下吧![图片]
7、基因的敲低/敲除/过表达
通常实验过程中，要证明某基因在细胞中行使什么样的功能，可以利用质粒及慢病毒等载体，在细胞中对该基因进行敲低（knockdown）、敲除（knockout）或过表达（overexpression），然后再通过RNA-seq、免疫荧光、细胞表型（迁移、侵袭、增殖、凋亡、周期）实验等，说明该基因在细胞内环境中行使的功能。
（1. Zhao W et al. METTL3 Facilitates Oral Squamous Cell Carcinoma Tumorigenesis by Enhancing c-Myc Stability via YTHDF1-Mediated m6A Modification. Mol Ther Nucleic Acids. 2020；
2. N6-Methyladenosine METTL3 Modulates the Proliferation and Apoptosis of Lens Epithelial Cells in Diabetic Cataract. Mol Ther Nucleic Acids. 2020）
8、动物模型
是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物，可分为自发性动物模型和诱发性动物模型。
动物疾病模型，主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（包括新药筛选）研究，涵盖动物病理解剖、HE染色、免疫组织化学检测等。
（1. RNA N6-methyladenosine methyltransferase-like 3 promotes liver cancer progression through YTHDF2-dependent posttranional silencing of SOCS2.Hepatology. 2018 Jun；
2. Anti-tumour immunity controlled through mRNA m6A methylation and YTHDF1 in dendritic cells. Nature. 2019 Feb）
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