通讯作者

这篇文章讲了三部分：

一是：他们开发了一种CellTagging的方法，可以并行捕获克隆历史和细胞身份，其中给细胞多轮加标签的方法可以构建多级谱系树。

二是：在小鼠成纤维细胞重编程为诱导的内胚层祖细胞的过程中，通过CellTagging和纵向追踪，揭示了两种轨迹：成功重编程和死亡状态，并且这两种发展轨迹的确定是在早期阶段就确定了。

三是：发现了甲基转移酶Mettl7a1的表达与成功重编程有关。控制该基因的表达会增加诱导的内胚层祖细胞的产量。

abstract

BACKGROUND

Reprogramming and direct reprogramming

首先是细胞重编程，受精卵发育为胚胎再到终端已分化细胞，他们的分化潜力是逐步丧失的，在2006年，山中伸弥通过将4个基因插入到成纤维细胞的DNA中，使细胞重编程为诱导多功能干细胞。这种干细胞可以再生为其他细胞，进而用来治疗疾病。而细胞直接重编程，省去了其中“诱导多功能干细胞”这一步，直接让细胞A重编程细胞B。

Reprogramming and direct reprogramming

本文所选用的是小鼠成纤维细胞直接重编程为内胚层祖细胞，这种直接重编程机制的机制是由FOXA1和HNF4α这两个转录因子决定的。

MEF->iEPs

Lentiviral system

然后本文用到了慢病毒系统，这种方法可以将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到外源基因的持久性表达。该病毒基因组主要由三个基因组成，分别是gag, pol, 和env，以及其他调控基因。目前通常用第二代或者第三代系统进行研究，第二代包含三个质粒，第三代包含四个质粒。这两个位置的transgene一般是我们想转入的基因。

Lentiviral system    Lentiviral system   

CellTagging

本文的CellTagging也是基于慢病毒系统构建起来的。在慢病毒系统中加入8bp的可变区域，这样就可以随机产生4的8次方个标签。对于第二轮和第三轮的celltag，在上游分别加入6bp长度的序列，用来区分celltag。因为慢病毒能把这些序列整合到宿主的染色体上并持久性表达，因此这相当于把细胞贴上标签，而且这些细胞的后代也会还有这些标签。

CellTagging

Comparison of InDrop, Drop-seq and 10X genomics

此外，这篇文章验证自己实验准确性时，用了两种单细胞测序方法：drop-seq和10X genomics。我就查阅比对这三种方法的文献。发现10Xgenomics优势相对来说更大，例如说珠子的质量更好、有效读取率大、灵敏度高。

Comparison of InDrop, Drop-seq and 10X genomics  

正文部分：

第一部分：

作者首先介绍了CellTag数据处理和过滤的方法，并证明了CellTag这种实验方法的可行性。

提取数据后构建表达矩阵，接着为减小PCR和测序的误差对错误进行纠正，然后进行第一次过滤，除去白名单上没有的数据以保证都存在于慢病毒文库中，第二次过滤出去小于2和大于20个celltag的细胞数据，之后用jaccard分析来识别相关细胞。右边这两个图分别是白名单过滤前后和细胞过滤前后的数据对比。

CellTag数据处理和过滤的方法，并证明了CellTag这种实验方法的可行性

之后作者通过加上celltag的细胞和对照组，发现每个细胞表达的基因和UMI都很没有明显的差别，并且平均表达量也高度相关。上面的一行图做的是pre-B cell和对照，下面一行做的是MEF重编成iEP的细胞和对照。以此来证明给细胞加上tag并不会影响细胞的生理和重编程效率。

给细胞加上tag并不会影响细胞的生理和重编程效率

这篇文章的方法是，在诱导MEF重编程的过程中，分别在第0、3、13天加3轮的celltag，并且每3-7天取出来一些细胞进行测序。每次取出来的细胞用两种方法dropseq和10X的方法进行测序。

方法

Timecourse1 Timecourse2是10X genomics的两个生物学重复；Timecourse3和Timecourse4是dropseq的两个生物学重复。C图表明两种方法的生物学重复都有很强的相关性。D图表明10X genomics和dropseq两种方法的相似性。E图选取了两个具有代表性的基因，C基因是MEF的marker，A基因是IEP的marker，这也表明了技术和生物学重复的一致性。

技术和生物学重复的一致性

第二部分：

作者为了调查重编程的动态，首先把28天的重编程过程用t-sne分成13簇，之后分析了每个簇的基因表达，揭示了成纤维细胞身份的逐步沉默。

成纤维细胞身份的逐步沉默

F图显示出时间变化，细胞身份的逐渐转变，identity score的数值小于0.25归类为MEF细胞，大于0.75归类为成功重编程的iEP细胞。作者的结果表明，很多细胞都开始了重编程，但仅有小部分细胞完成了重编程。通过marker的表达和identity score，可以把重编程的进程分为四个阶段：呈现为细胞、转化前期、转化期和完成重编程。

重编程的进程分为四个阶段：呈现为细胞、转化前期、转化期和完成重编程

第三部分：

C图显示克隆487的两个分支240和204，在d图中可以观察到：240和204的转录等高线图和487很相似，而不相关的克隆329就看起来很不相关。因此作者证明：克隆相关的细胞，在转录上相似。

作者通过分析观察到：许多谱系中的IEP的富集或耗竭。为对此进行量化，在重编程后期对细胞进行了聚类。他发现有8%的细胞归为完全重编程的聚类。他进行了随机测试，发现20个富集克隆，其中克隆中20-50%的细胞发生了完全重编程，24个耗竭克隆中少于3%的细胞发生了完全重编程。

一种是IEP富集的成功重编程，一种是IEP耗竭的dead-end

IEP的富集或耗竭在等高线图上有明显差异，也表明存在着两种轨迹，一种是IEP富集的成功重编程，一种是IEP耗竭的dead-end。

一种是IEP富集的成功重编程，一种是IEP耗竭的dead-end   一种是IEP富集的成功重编程，一种是IEP耗竭的dead-end

通过计算占据成功重编程和dead-end两种轨迹的细胞比例图，发现tagD3标记的克隆和tagMEF标记的亲本重编程效率相似，特别是重编程效率比较高的谱系，因此，作者猜想成功重编程和dead-end的这两种重编程结果可能是在早期就被决定。

成功重编程和dead-end的这两种重编程结果可能是在早期就被决定

最后一部分：

M基因编码了一种类甲基转移酶，能调控干细胞分化和多能细胞的重编程，因此作者对该基因进行研究。

图中可以看到，表达该基因后，IEP克隆成倍的增加。

另外，加入M基因实验和对照相比，每个克隆的平均细胞数量没有显著差异，但细胞进入完全重编程状态的数量增多。因此M并不是扩大现有的IEP，而是增大重编程效率。

M并不是扩大现有的IEP，而是增大重编程效率