背景
二代测序建库时，当连接好接头之后，需要进行PCR，而目的是什么？对后续生信分析有何影响？
为什么需要PCR？
一般是因为DNA浓度过低，取样上机时只有很少一部分DNA被捕获到，导致基因组很多区域没有测到。这也是DNA输入量影响覆盖度的重要原因之一。
而不足的原因就有很多了，比如本身input量就很低（cfDNA、FFPE及其他低DNA含量组织），或者是本来DNA量是够的，但是在处理过程中（比如超声波打断、酶切、重亚硫酸氢盐转换等）DNA发生了部分降解，导致一些片段丰度降低。同样不能被 flowcell 上的接头捕获。
所以，那些低丰度的DNA分子在扩增之后多少就能够被捕获到了，以提高覆盖度。
但是PCR步骤也会带来一些问题。
为什么需要去重？
理想情况下，不管P不PCR，这些片段被捕获的概率相同，但是PCR存在着偏好性，即不同的DNA分子被扩增的次数不尽相同，片段长度、GC含量都会有影响。
因此，对于随机打断的建库方式来说（比如WGBS、ATAC-seq、ChIP-seq），如果后续比对后发现reads的起始、终止及之间的序列完全相同，则为PCR产生的duplicate，如果不去重的话，则直接影响到丰度和最终的读值。
而对于本身或建库过程中就会产生大量重复序列的建库方式来说（比如RNA-seq、RRBS、TBS），这些duplicate本身就是存在的有意义的，而不是无效拷贝，因此必须保留。
去重的工具
直接去除
- samtools rmdup
- sambamba markdup -r
只标记不去除
- sambamba markdup
- picard MarkDuplicates
在需要时再去除，比如WGBS数据的分析，在提取甲基化读值的步骤MethylDackel extract时，则自动不提取标记为重复的reads
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