本文将介绍骨架载体+目的基因序列合成方法

在合成之前，应该先确定骨架载体backbone+基因序列。其中，骨架载体是根据自己的实验需要来决定。

一：目的基因获取

在进行PCR之前，需要①先针对自己的基因设计对应的引物；②提取与所需表达的基因同源的细胞或组织中的RNA，并经过RT程序将其转化为cDNA；③PCR扩增出所需要的基因片段。

1.设计构建载体所需引物

引物设计部分可参照前文。LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计 - 简书

2.PCR扩增：引物+cDNA样品+PCR体系（DNA聚合酶、buffer、dNTPs）

PCR扩增的步骤及原理1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2. 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3. 引物的延伸：DNA模板－引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

经常用的DNA聚合酶有耐高温的Taq酶，买的同时会附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些还有(NH4)2SO4)

拿到引物后最好先高速离心，12000rcf, 4°C离心2min，再加DEPC水溶解，置于-20℃保存，可适当分装。

PCR扩增反应体系及程序设定：

2XPhanta max master mix：25ul

F：1ul（20uM）

R：1ul（20uM）

cDNA：23ul（1ug RNA逆转录后，再稀释10倍）

反应程序：

①95℃ 3min，②95℃ 15s→60℃ 15s→72℃ 1000bp/min(30个循坏，不能多），③72℃ 10min，④4℃ (持续）。

退火温度的选取：通常情况下，可以尝试用两条引物中较低的Tm值减去5℃来作为退火温度，但是这种方法有时候会不适用，在不适用的情况下可以考虑做12个退火温度，这样试下去，总会找到合适的退火温度。

3.cDNA纯化:跑DNA凝胶+胶回收

配胶：琼脂糖凝胶浓度选择：脂糖的浓度，这部分参数是根据目的片段的大小选择的，一般500bp以下选择1.2%-1.5%（质量体积比）500bp-10kb可以选择0.8%-1%，分子量再高的话琼脂糖浓度就再低点。胶的配置：1X TAE+琼脂糖粉+Gel Red

本实验中，有两种大小的的目的序列，过表达：①6810bp；②3800bp；敲低序列：③15~20bp。因此要配置1.5%的琼脂糖，跑敲低序列的cDNA；配置0.8%的琼脂糖，跑过表达的序列。

电泳：样品中加入DNA loading buffer，上样，样品在负极，电泳条件：120V 40min 电泳。注：胶的浓度越低，跑的电压最好也相应地变低，并增加电泳时间。这样可以防止条带跑成一个U型。

胶回收：跑完DNA电泳后，使用手持紫外灯切胶，用胶回收试剂盒回收cDNA。

（2）载体和目标片段的限制性酶切：

①过表达全长：使用XhoI和XbaI对plvx-puro质粒做双酶切；对上游引物1和下游引物1引出的cDNA以同种酶做双酶切。

②过表达半长：使用BamHI和XbaI对plvx-puro质粒做双酶切；使用XhoI和XbaI对上游引物2和下游引物2引出的cDNA做双酶切；再用BamHI和XhoI对pcDNA3.1-AFAP1-AS1质粒做双酶切（注：这一步是因为答主已经做出来了1-3010片段，前半段的设计和后半段的设计原则一样，在此不再赘述）。

双酶切体系：

一共30uL体系，需要按照次序加入，最好不要改变顺序！！！

①无酶ddH2O 或DEPC：补足至30uL

②plasmid：体积=3~5ug/质粒浓度

③10X cutsmart：3uL

④限制性内切酶1：2uL

⑤限制性内切酶2：2uL

注：以上酶切是为了做胶回收，如果仅仅是双酶切验证，可将质粒改成1ug，内切酶仅需0.5uL，总体系10uL即可。毕竟内切酶也很贵啊！

（3）连接转化：

①载体：载体浓度在20-100 ng/uL最好，体系内总量50-100 ng即可。如果所选载体多克隆位点上的俩个酶切位点比较近，甚至相邻，最好分步酶切载体，比双酶切效果好的多。

②总体积：通用10-15 uL

③载体和插入片段比例：一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10

④大片段相连:越大的片段越难连接，可采用方法a.减小反应体系，以提高反应体系中载体和插入片段的浓度；b.适当增加T4的用量；c.对大片段分成几个小片段，再依次连接到载体上，两两相连。

⑤多片段相连：多片断的连接最经常的做法是顺次俩俩连接（目的片断和载体片断的连接），采用载体上的多克隆位点，此时应注意酶切位点的顺序。

千万要注意，不能直接把目的片段ABC连一起，而应该依次把目的片段依次克隆到载体上去，否则就会出现下图中的结果：出现很多条不明确条带（末端自连导致的）

注意所有片断两端的酶，是否存在同尾酶和同裂酶，例如BamHI和Bgl II是同尾酶，Sal I和Xho I 是同尾酶；同尾酶-百度百科，同裂酶-百度百科。

质粒酶切回收大片段与目的基因连接，连接反应在16℃反应过夜。DNA连接体系可根据本组使用的酶说明书来确认。

取10ul连接产物与50ul 感受态细菌（对于慢病毒载体，最好选择stable3菌株，更有利于质粒稳定；而对于原核表达的载体，最好选择Rosetta菌株）混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置5min,加入预热至室温的500ul LB培养基， 37℃恒温培养60min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含50ug/ml Ampicillin抗性（根据骨架载体的特征来选，这里用的是pLvx质粒，因此选Amp）的LB平板上， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

（4）挑取克隆提质粒验证：

挑取5个单菌落接种于含5ml，载体对应抗性的LB培养液中，200rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行双酶切验证、测序验证。