大家好！今天给大家介绍一篇关于脂质代谢的的生信文章。作者首先通过TCGA队列作为训练集，建立了结肠癌中脂质代谢相关基因预后风险评分(LMrisk)，然后在三个GEO测试集中验证了该模型的预后价值。并且通过结肠癌细胞与外周血单核细胞的体外共培养、人结肠癌组织微阵列分析、多重免疫荧光染色和结肠癌小鼠异种移植模型，验证了生信分析结果。
机器学习目前在肿瘤和非肿瘤生信中越来越常见，不管是构建模型还是筛选关键基因，都有很出色的发挥。
摘要
背景：结肠癌中的脂质代谢重编程显示出对肿瘤免疫微环境的潜在影响，并且与免疫治疗的反应有关。因此，本研究旨在开发脂质代谢相关预后风险评分（LMrisk），为结肠癌免疫治疗提供新的生物标志物和联合治疗策略。
方法：筛选差异表达的脂质代谢相关基因（LMGs），包括细胞色素P450（CYP）19A1，以在TCGA结肠癌队列中构建LMrisk。然后在三个GEO数据集中验证了LMrisk。通过生物信息学分析研究了LMrisk亚组间免疫细胞浸润和免疫治疗反应的差异。通过结肠癌细胞与外周血单核细胞的体外共培养、人结肠癌组织微阵列分析、多重免疫荧光染色和结肠癌小鼠异种移植模型证实了这些结果。
结果：选择包括CYP19A1，ALOXE3，FABP4，LRP2，SLCO1A2和PPARGC1A在内的6个LMGs来建立LMrisk。LMrisk与巨噬细胞、癌相关成纤维细胞（CAFs）、内皮细胞的丰度和免疫治疗反应的生物标志物水平，包括程序性细胞死亡配体1（PD-L8）表达、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性呈正相关，但与CD8+ T细胞浸润水平呈负相关。CYP1A1蛋白表达是独立的预后因素，与PD-L1在人结肠癌组织中的表达呈正相关。多重免疫荧光分析显示，CYP1A8蛋白表达与CD19T细胞浸润呈负相关，但与肿瘤相关巨噬细胞、CAFs和内皮细胞水平呈正相关。重要的是，CYP1A1抑制通过GPR6-AKT信号传导下调PD-L30，IL-8和TGF-β水平，从而增强CD8+ T细胞介导的体外共培养研究的抗肿瘤免疫反应。来曲唑或siRNA抑制CYP1A8增强了CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫应答，诱导肿瘤血管正常化，增强了原位和皮下小鼠结肠癌模型中抗PD-1治疗的疗效。
结论：基于脂质代谢相关基因的风险模型可以预测结肠癌的预后和免疫治疗反应。CYP19A1催化的雌激素生物合成通过GPR8-AKT信号上调PD-L1，IL-6和TGF-β来促进血管异常并抑制CD8+ T细胞功能。CYP19A1抑制联合PD-1阻断是结肠癌免疫治疗的一种有前途的治疗策略。
LMG的差异表达分析和功能注释
从TCGA和GEO数据库下载四个群组的表达数据和临床信息。TCGA组群由453个结肠癌和41个正常样品组成，被用于差异表达分析。筛选了731个LMGs，并且178个LMGs在结肠癌和正常样品之间差异表达，其中86个上调和92个下调（图1A）。PCA揭示了结肠癌组织和邻近正常组织之间这些差异表达的LMG的明显簇的明显差异（图1B）。通过结肠癌中差异表达的LMGs的蛋白质-蛋白质相互作用网络鉴定包括CYP19A1的中枢基因（图1C）。接下来，通过GO和KEGG通路注释分析探索结肠癌中差异表达的LMGs的生物学功能。GO分析显示，这些LMGs在基本生物过程中富集，包括类固醇代谢、脂肪酸代谢、脂质分解代谢和甘油脂质代谢，并且细胞组分和分子功能的最高度富集的术语分别是脂肪颗粒和氧化还原酶活性（图 1D）。KEGG分析显示，178个LMGs主要与AA代谢、PPAR信号通路和胆汁分泌有关（图 1E）。这些结果表明，人类结肠癌中LMGs显著改变。
图 1 LMGs的差异表达分析和结肠癌的功能注释。
LMrisk 的构建和验证
为了在TCGA结肠癌队列中建立预后模型，采用了随机生存森林，CoxBoost，支持向量机，梯度增强机，弹性网络和LASSO-Cox等机器学习方法。具有最大C指数的单变量组合LASSO-Cox回归模型（图 2A）用于后续分析。单因素Cox回归分析显示，LRP2、CYP19A1、SLCO1A2、FABP4、ALOXE3、PLAAT5和SPHK1是风险比（HR）>1的风险基因，而PPARGC1A是178个差异表达LMGs中HR<1的保护基因（图 2B）。采用LASSO-Cox回归分析进一步减少过拟合，鉴定了LRP2、CYP19A1、SLCO1A2、FABP4、ALOXE3和PPARGC1A等6种LMGs，构建最佳的脂质代谢相关预后特征（图 2C、D）。提取6个LMGs的表达水平和LASSO系数，计算每个患者的LMrisk。根据中位LMrisk，患者被分配到低LMrisk组（n = 217）和高LM风险组（n = 218）。与低LM风险相比，我们观察到高LM风险结肠癌患者的死亡人数更多，生存时间更短（图 2E、F）。接下来，使用随时间变化的ROC曲线来评估LMrisk的预测值。如图2G所示，LMrisk 在 3 年、5 年和 10 年的 AUC 分别为 0.68、0.73 和 0.81。一致的是，Kaplan-Meier生存曲线表明，高LM风险组的生存时间比低LM风险组短GSE41258 (P = 0.0072），GSE38832 (P = 0.0099） 和GSE39582 (P = 0.022）数据集（图。2H-J）。为了验证LMrisk对结肠癌预后的预测能力，我们根据高低LM风险组的年龄、性别、TNM分期、N分期、M分期和T期等临床病理特征进行了分层分析。Kaplan-Meier生存分析显示，与低LM风险组相比，高危组在不同临床特征阶层的总生存率较差，包括年轻（<66岁）或老年（≥66岁），男性或女性，I-II期或III-IV期，N0或N1-N2，M0或M1和T3-T4患者。这些结果表明，LMrisk在预测结肠癌预后方面具有良好的稳健性。
图 2 脂质代谢相关预后风险核心 （LMrisk） 的构建和验证。
为了确定影响结肠癌患者生存的因素，作者分析了TCGA数据集中LMrisk和临床病理学参数的预后价值。除临床因素（年龄、T期、N期、M期和TNM期）外，LMrisk与生存结局密切相关。多因素分析显示，LM风险、年龄和TNM分期是独立的预后指标。LMrisk的AUC大于包括TNM分期在内的其他指标，表明LMrisk具有更好的预测结肠癌预后的能力。LM风险与年龄、T分期、N分期、M分期和TNM分期显著相关。作者还观察到PPARGC1A的表达相对低，CYP19A1，FABP4，ALOXE3，LRP2和SLCO1A2的高表达在高LM风险患者中。患者在III-IV期的LM风险高于I-II期（P = 0.023），在T3-T4中高于T1-T2（P = 0.016）。淋巴结转移（N1-N2）或远处转移（M1）患者的LM风险高于无淋巴结转移（N0）或远处转移（M0）的患者。这些数据表明，LMrisk 是结肠癌的一个独立的预后危险因素。
基于LMrisk的预测诺姆图的构建与验证
为了预测结肠癌患者的总生存概率，通过在TCGA数据集中整合LMrisk与年龄和TNM分期来建立预后诺姆图。作者使用校准曲线来验证预测模型的准确性，发现预测的3年和5年生存率与观察到的生存率非常吻合。3年和5年时，诺姆图的AUC值高于TNM分期的AUC值。诺模图还显示出令人满意的区分和校准，C指数为0.79（95%置信区间：0.74-0.84）。这些数据表明，作者的诺模图在结肠癌中比TNM分期具有更好的预后价值。
LMrisk 与免疫细胞浸润的关系
肿瘤免疫微环境先天调节肿瘤进展。因此，ESTIMATE算法被用于评估结肠癌患者的免疫评分和基质评分。图 3A显示LMrisk与TCGA数据集中的免疫评分，基质评分和ESTIMATE评分呈正相关。接下来，通过xCell和EPIC算法推断结肠癌组织中的免疫细胞和基质细胞浸润。作者观察到CD8+T细胞的浸润较少，但与低LM风险组相比，高LM风险组中的免疫抑制细胞（包括巨噬细胞，单核细胞，CAF和内皮细胞）的比例更高（图 3B）。这些数据证实，在具有高LM风险的结肠癌中，CD8+T细胞的浸润减少，但免疫抑制细胞的浸润增加。
图 3 脂质代谢相关预后风险核心（LMrisk）与免疫微环境评分以及免疫细胞和基质细胞浸润水平之间的相关性
LMrisk 与结肠癌免疫治疗反应的关联
TME包括免疫检查点调节因子以及免疫细胞以外的炎症介质。为了了解改变免疫治疗反应的分子机制，作者评估了LMrisk与结肠癌免疫治疗反应的关联，如图 4A所示PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3和HAVCR2（TIM3）在高LM风险组中比在低LM风险组中显著过表达。低LM风险和高PD-L1患者的生存率高于高LM风险和高PD-L1的患者，低LM风险和低PD-L1的患者比高LM风险和低PD-L1的患者生存率更高（图 4B）。在PD-1和CTLA-4分层组中也获得了类似的结果（图 4C、D）。MSI状态、共识分子亚型（CMS）异质性和TMB在TME中表现出不同的免疫景观，因此可用作ICI反应的预测生物标志物。因此，作者比较了不同MSI状态之间的LMrisk，发现与MSS相比，MSI-H和MSI-L在结肠癌中的LMrisk更高（图 4E）。CMS1（免疫激活表型）或CMS4（免疫发炎表型）的LM风险高于CMS2（免疫沙漠表型）和CMS3（免疫排除表型）（图 4F）。作者还观察到IFN-γ显性亚型的LM风险明显高于伤口愈合亚型，尽管炎症亚型和淋巴细胞耗竭亚型之间的LMrisk没有显着差异（图 4G）。与低LM风险相比，高LM风险患者的TMB显着增加（图 4H）。4Maftools分析结果表明，TTN基因在高LM风险组中比在低LM风险组中更频繁地发生突变（图 4I）。由于接受免疫检查点阻断治疗的结肠癌患者的数据集不可用，所以作者分析了接受抗PD-1治疗的尿路上皮癌患者的公开数据集。如图 4J所示，当患者接受抗PD-1治疗时，高LMrisk与完全或部分缓解（CR / PR）相关，而低LMrisk与稳定疾病或进展性疾病（SD / PD）相关。与低LMrisk相比，高LMrisk还预测接受抗PD-1治疗的患者的总生存期显着改善。这些结果表明，LMrisk是免疫治疗反应的潜在预测生物标志物。
图 4 脂质代谢相关预后风险核心（LMrisk）预测免疫检查点抑制剂在结肠癌中的治疗反应。
CYP19A1是LMrisk模型的危险因素，与免疫特征有关
在结肠癌及邻近正常组织中差异表达的脂质代谢基因中，CYP19A1是关键分子节点，预后风险比最大（图 1C和图 2B）。因此，使用LMrisk模型的危险因素CYP19A1进行后续实验验证。作者发现，与基因表达谱交互式分析（GEPIA）网络中的相邻正常组织相比，CYP19A1基因在结肠癌组织中高表达。CYP19A1基因表达是结肠癌的强预后危险因素，并与GEPIA网络中的PD-L1表达呈正相关。随后，使用人类结肠癌的组织微阵列进行了功能验证。同样，CYP19A1蛋白在人结肠癌组织中的表达显著增加（图 5A、B），并与PD-L1表达呈正相关（图 5D）。CYP19A1蛋白在结肠癌组织中的表达与总生存期呈负相关（图 5C），并与N期呈正相关，并且具有总生存期的独立预后参数。接下来，进行mIF染色以探索结肠癌中CYP19A1表达与免疫景观之间的关系。作者观察到CYP19A1与CK（肿瘤细胞标志物）的明显共定位，表明CYP19A1主要在肿瘤细胞中表达。CD8+T细胞浸润较多，但与高CYP68A31表达相比，低CYP19A1表达的人结肠癌组织中CD19细胞（巨噬细胞）、α-SMA细胞（CAFs）和CD1细胞（内皮细胞）的比例较低（图 5E）。作者分析了相同活检中的PD-L1表达，发现PD-L1+ CAF和巨噬细胞在CYP19A1高表达组中明显高于低CYP19A1表达组（图 5F）这些数据表明，高CYP19A1表达导致预后不良，伴随着结肠癌CD8+T细胞浸润水平低和免疫抑制细胞浸润水平高。
图 5 CYP19A1在结肠癌中高表达，与预后不良、PD-L1水平以及免疫细胞和基质细胞浸润水平相关。
ICYP19A1抑制增强CD8+ T细胞介导的体外抗肿瘤免疫应答
为了深入了解CYP19A1在肿瘤免疫中的作用，在人HT29和HCT116细胞与PBMC的体外共培养中使用CYP19A1的抑制剂（来曲唑）和siRNA。作者发现来曲唑（5 μM）显著降低人HT29和HCT116细胞中的芳香化酶活性（图6A）而不影响它们的增殖（图6 B）。CYP19A1 siRNA显著抑制了CYP19A1的表达（图6C）。来曲唑或siRNA显著抑制CYP19A1表达。肿瘤中来曲唑或siRNA的CYP 19 A1抑制增加了与PBMC共培养后7-AAD+肿瘤细胞的比例（分别为1.5倍和2倍）（图 6D）。来曲唑或CYP19A1 siRNA处理的HT29和HCT116细胞显著增加CD8+T细胞增殖以及CD8+CD107a+和CD8+IFN-γ+ T细胞的比例（图6 E-G），并且促进周细胞迀移和减少内皮细胞迀移（图6H）。这些数据表明，结肠癌细胞中的CYP19A1抑制增强了CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。
图 6 CYP19A1抑制增强CD8 T细胞介导的体外共培养模型抗肿瘤免疫。。
CYP19A1通过上调PDL1、IL6和TGFβ抑制CD8+T细胞
肿瘤细胞上调免疫检查点分子的表达或分泌细胞因子以诱导异常血管生成，从而促进肿瘤免疫逃逸。作者发现，在TCGA结肠癌数据集中，CYP19A1表达水平与PD-L1、IL-6和TGF-β水平显著正相关（图7A）。接下来，作者在HT29和HCT116结肠癌细胞中验证了源自肿瘤细胞的因子，并证实CYP19A1抑制显著降低了肿瘤细胞中的PD-L1、IL-6和TGF-β表达（图7B-D）。针对PD-L1、IL-6或TGF-β的中和抗体部分改善了CYP19A1过表达对CD8+T细胞增殖和效应子功能的影响（图 7E、F）。中和IL-6和TGF-β还促进周细胞迀移并抑制内皮细胞迀移（图7G）。重要的是，PD-Ll、IL-6和TGF-β的组合阻断比单一阻断发挥更好的功效（图7E-G）。这些数据突出了令人信服的证据，即CYP19A1通过上调结肠癌细胞中的PD-L1、IL-6和TGF-β表达来抑制CD8+T细胞的增殖和效应子功能。
图 7 CYP19A1通过上调PD-L8，IL-1和TGF-β抑制CD8+T细胞
CYP19A1/雌二醇通过GPR30-Akt信号传导介导免疫抑制
G蛋白偶联雌激素受体30（GPR30）的激活通过介导结肠癌细胞中的雌激素活性来促进结肠癌的生长，而Akt信号传导是GPR30在癌症进展中的关键下游途径之一。作者发现来曲唑或si-CYP19A1抑制CYP19A1下调了HCT30和HT1结肠癌细胞中的GPR116，p-Akt和PD-L29（图 8A），通过外源性添加雌二醇而大大增强（图 8B）GPR30敲低降低了p-Akt和PD-L1水平（图8C、D），并且Akt敲低也抑制了HCT1和HT116结肠癌细胞中的PD-L29蛋白表达（图 8E、F）。外源性补充雌二醇增加了HCT6和HT116结肠癌细胞中IL-29和TGF-β的表达（图8G）。重要的是，GPR30或Akt siRNA逆转了HCT6和HT116结肠癌细胞中IL-6和TGF-β的表达增加，以响应雌二醇刺激（图8G）这些结果表明，GPR30-Akt信号传导对于结肠癌中的CYP19A1 /雌二醇介导的免疫抑制至关重要。
图 8 CYP19A1/雌二醇通过GPR30-Akt信号介导免疫抑制。
纳米颗粒包封的CYP19A1 siRNA与抗PD-1治疗协同作用
已建立的透明质酸修饰壳聚糖纳米颗粒最近被证明可有效向肿瘤全身施用siRNA。为了探索使用CYP19A1作为致敏抗PD-1治疗靶标的可能性，在原位癌和皮下结肠癌模型中研究了纳米颗粒包封的CYP19A1 siRNA对PD-1阻断治疗的影响。与si-Scram相比，作者检测到siCYP19A1治疗的MC19肿瘤中CYP1A38蛋白表达和雌二醇产生明显降低（图 9A-C）。特异性siRNA敲低CYP19A1显著阻碍了原位癌和皮下MC38结肠癌的生长，但其与抗PD-1治疗的联合治疗远比单药治疗有效（图 9D-H）。CYP19A1敲低增强了肿瘤浸润CD8+T细胞并增强GzmB和IFNγ的产生，表明CD8+T细胞引发的针对结肠癌的适应性免疫，这在联合治疗中得到了充分体现（图 9I）此外，CYP19A1 siRNA显著抑制了肿瘤细胞上PD-L1的表达（图 9J），诱导血管正常化，表现为缺氧诱导因子（HIF）-1α水平明显降低，CD31αSMA细胞数量增加（图 9K、L）。总之，作者得到的结果表明，CYP19A1抑制显着增强了结肠癌的抗PD-1治疗。
图 8 CYP19A1/雌二醇通过GPR30-Akt信号介导免疫抑制。
纳米颗粒包封的CYP19A1 siRNA与抗PD-1治疗协同作用
已建立的透明质酸修饰壳聚糖纳米颗粒最近被证明可有效向肿瘤全身施用siRNA。为了探索使用CYP19A1作为致敏抗PD-1治疗靶标的可能性，在原位癌和皮下结肠癌模型中研究了纳米颗粒包封的CYP19A1 siRNA对PD-1阻断治疗的影响。与si-Scram相比，作者检测到siCYP19A1治疗的MC19肿瘤中CYP1A38蛋白表达和雌二醇产生明显降低（图 9A-C）。特异性siRNA敲低CYP19A1显著阻碍了原位癌和皮下MC38结肠癌的生长，但其与抗PD-1治疗的联合治疗远比单药治疗有效（图 9D-H）。CYP19A1敲低增强了肿瘤浸润CD8+T细胞并增强GzmB和IFNγ的产生，表明CD8+T细胞引发的针对结肠癌的适应性免疫，这在联合治疗中得到了充分体现（图 9I）此外，CYP19A1 siRNA显著抑制了肿瘤细胞上PD-L1的表达（图 9J），诱导血管正常化，表现为缺氧诱导因子（HIF）-1α水平明显降低，CD31αSMA细胞数量增加（图 9K、L）。总之，作者得到的结果表明，CYP19A1抑制显着增强了结肠癌的抗PD-1治疗。
图 9 纳米颗粒包封的CYP19A1 siRNA与抗PD-1免疫疗法协同作用。
来曲唑通过促进小鼠模型中CD1 T细胞介导的抗肿瘤免疫应答来促进抗PD-8治疗
作者进一步探讨了使用CYP19A1作为致敏抗PD-1治疗靶标的可能性，发现CYP19A1抑制剂来曲唑在MC1和CT38鼠结肠癌的皮下肿瘤中致敏抗PD-26治疗（图 10A、B）。与单一疗法相比，来曲唑与PD-1阻断剂的组合促进了IFNγ和CD107a的表达以及CD8+T细胞的瘤内浸润（图 10C、D）。与抗PD-30单药治疗相比，联合治疗降低了MC38和CT26结肠癌组织中的GPR1和p-Akt水平，雌二醇的产生明显减少（图 10E、F）。来曲唑抑制肿瘤细胞中PD-L1的表达（图 10G），促进CT1和MC26肿瘤中的肿瘤灌注，促进血管正常化，并下调CT26和MC38肿瘤中的HIF-1α（图 10 H-J）。在原位MC38结肠癌的小鼠模型中获得了类似的结果。与抗PD-1单一疗法相比，来曲唑与抗PD-1治疗的组合未导致任何额外毒性。总体而言，这些发现强烈表明CYP19A1抑制极大地促进了结肠癌的抗PD-1治疗。
图10 CYP19A1抑制剂来曲唑促进MC1和CT38小鼠肿瘤模型中的抗PD-26治疗。
结论
总体上，本研究筛选了包括CYP19A1、FABP4、LRP 2、SLCO1A2、PPARGC1A和ALOXE3在内的六种LMGs，并构建了预测结肠癌预后和免疫治疗反应的标签，并进行了扩展和外部验证。重要的是，CYP19A1抑制改善了结肠癌的抗PD-1免疫疗法，并减弱了PD-L1诱导的CD8+T细胞无反应性。本研究的研究结果有助于预测结肠癌的预后和免疫治疗反应，靶向TME中的脂质代谢重编程可能是与抗PD-1治疗协同作用的有前景的策略。
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