Listeria hijacks host mitophagy

Zhang, Y., et al. (2019)."Listeria hijacks host mitophagy through a novel mitophagy receptor toevade killing."Nat Immunol.

摘要：细胞通过线粒体自噬来移除受损的线粒体。在这篇文献中，作者报告了，Lm能够利用宿主细胞的线粒体自噬来逃避宿主细胞的杀伤。Lm通过LLO来诱导宿主细胞的线粒体自噬。NLRX1是NLR家族的成员，含有LC3相互作用区域（LIR），通过LIR直接与LC3结合。NLRX1与它的LIR模序对于Lm诱导的线粒体自噬有着重要的作用。NLRX1缺陷或者是使用一个线粒体自噬抑制剂，由能增加线粒体活性氧的产生，从而抑制Lm的存活。从机制上讲，Lm与LLO能诱导NLRX1的寡聚化，促进LIR模序与LC3的结合，进而诱导线粒体自噬。作者的发现了NLRX1是一个新的线粒体自噬受体。

背景知识

自噬小体先在线粒体周围形成，然后与溶酶体溶合，进而诱发线粒体自噬。线粒体盺 靶点是由线粒体特异性的受体识别的，这种受体含有LIR模体，它们能招募被LC3修饰的自噬小体。目前已经鉴定出了三个线粒体自噬受体，分号为Nix（BNIP3L），BNIP3与FUNDC1，它们三个都含有LIR模体，位于线粒体外膜上。Nix是第1个被报告的参与移除线粒体的受体，它通过诱导羰基氰化物（carbonyl  cyanide）m-chlorophenylhydrazone（CCCP）

或低氧来实现。BNIP3和FUNDC1对于低氧（hypoxia）诱导的线粒体自噬也有着重要作用。除了这三个线粒体自噬受体外，PINK1-Parkin也是构成线粒体自噬的一个重要机制，而PINK1-Parkin则依赖于线粒体自噬的泛素系统。PINK1是一个线粒体激酶，当线粒体自噬诱导CCCP时，PINK1就会参与自噬磷酸化（autophosphorylated）。活化的PINK1然后就会招募磷酸，泛素，以及E3泛素连接酶Parkin，导致Parkin的活化，将它从细胞质转移到受损的线粒体上，促进线粒体自噬。PINK1介导的泛素磷酸化也会招募自噬受体，例如OPTN与NDP52用于移除受损的线粒体。大多数的研究已经使用CCCP（CCCP，Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，是一种质子载体，强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，促使线粒体内膜对H+产生通透性，导致线粒体内膜两侧的膜电位丧失，诱导线粒体自噬发生）或OA（Oligomycin是ATP synthase Fo部分的抑制剂，Antimycin A可以破坏电子传递链的Q cycle。两者都可以破坏氢离子浓度梯度，进而影响线粒体的正常膜电势。）作为线粒体自噬的触发剂。但是，线粒体自噬触发的生理学或病理学机制还不清楚，哪些分子调控了线粒体自噬的特异性信号转导也不清楚。Lm是一种胞内菌，还不清楚细菌能否造成宿主的线粒体自噬。作者使用了Lm作为模式生物来研究了胞内菌诱导宿主的线粒体自噬。结果确定了Lm能诱导宿主免疫细胞的线粒体自噬，并确定了NLRX1是一种新的，由Lm诱导的线粒体自噬过程中的线粒体自噬受体。

Parkin是一种E3泛素连接酶，PINK1是一种泛素激酶，Parkin定位在细胞质中，在多数真核生物中非常保守。PINK1定位于线粒体外膜，是种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Parkin是自身抑制的，需要通过PINK1激活，激活后可以诱导线粒体缺陷自噬的发生（一种选择性形式的自噬），清除细胞内的“垃圾废物”。

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Fig1a-mtDNA是指的线粒体内DNA，它的降解程度是判断mitophagy的程度，从图中可知，Lm感染3，6h时，mitophagy程度逐步增强（mtDNA的降解增多）。表型类似于CCCP（线粒体自噬的诱导剂）

Fig1b-TIM23，HSP60逐步降低。TIM23线粒体内膜上的蛋白，HSP60是基质蛋白。这两个指标是判断mitophagy的指标，ab图说明了，Lm感染会诱发线粒体的自噬。

Fig1cd-Lm感染后，外源的GFP-LC3与线粒体共定位。

Fig1ef-Lm感染后，内源的LC3与线粒体共定位。cdef图说明了，Lm能诱导宿主细胞的线粒体自噬。

Fig1gh-用LysoTracker来标记溶酶体，发现感染后，lysosome与mitochondria共定位，这说明了Lm能诱导mitochondria的自噬，线粒体确实是被溶酶体降解了。

Fig1ij-电镜数据，Lm感染或CCCP干预后，线粒体被自噬小体包裹。Lm能诱导线粒体的减少是通过线粒体自噬实现的，而非细胞死亡。

Fig1kmn-THP-1细胞中的自噬情况。

Fig1中的数据都是表型数据，即发现了Lm能诱导宿主线粒体自噬，接着要找参与这个过程中的某个分子。

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CCCP诱导的线粒体自噬是通过PINK1-Parkin通路实现的，当PINK1或Parkin敲低后，CCCP就无法诱导线粒体自噬，但是Lm还能诱导线粒体自噬，因此可以说，Lm诱导的线粒体自噬并不涉及这个通路。附件中的数据指出，Lm感染会降低PINK1的mRNA水平。接着，作者研究了当前已知的线粒体自噬受体与Lm感染的关系，这三个受体分别为Nix，BNIP3与FUNDC1。作者在小鼠PM中分别高低了这3个受体，发现Lm仍能诱导线粒体自噬，而CCCP诱导的线粒体自噬则受到了抑制，这说明可能还存在着某个受体参与到了Lm诱导的线粒体自噬中。作者随后就假设存在着某个PRR可以识别线粒体的损伤，参与了LM诱导的线粒体自噬，并且这种受体有两个特点，一是定位在线粒体上，二是存在着一个LIR模序（它与LC3结合）。作者通过一个数据库iLIR检测到了一个蛋白，即NLRX，NLRX1含有一个LIR模序（位于NACHT结构域中）。

Fig2a-不同物种的NLRX1的保守结构域；

Fig2bc-在NOD样受体（NLRs，NOD-like receptors）中，LRR（C端富含亮氨酸的结构域）通常是弯曲的，与NLR的其它结构域结合，处于一种非活化状态。作者使用了野生型的NLRX1（NLRX1-WT）与一个敲除了LRR结构域的突变体（NLRX1-dLRR）来研究NLRX1与LC3的相互作用。结果显示，GST-LC3B都能把这两个NLRX1拉下来，并且NLRX1-dLRR比NLRX1-WT的结合能力更强，这说明，LRR结构域参与了NLRX1的自身抑制。C的数据表明，NLRX1能直接与LC3相互作用。

Fig3d-说明了LIR对于NLRX1-WT和NLRX1-dLRR和LC3B的结合有着重要意义。

Fig2ef-NLRX1-dLRR能持续并强烈地与GFP-LC3共定位。可以发现，NLRX1-dLRR与LC3结合的更多。

Fig2g-感染了LM后，LC3与NLRX1的结合更多。SE-short

exposure，

Fig2hi-LM感染后，NLRX1-WT与LC3的结合更多，这说明NLRX1与LC3的结合是能过LIR实现的。

FIg2的数据说明了，NLRX1有可能是CCCP诱导的线粒体自噬和LM诱导的线粒体自噬的一个受体。接着作者研究了NLRX1在LM感染过程中作用。

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Fig3a-NLRX1敲除小鼠的PM在LM感染后，mtDNA的变化不大，说明了NLRX1参与LM诱导的线粒体自噬。

Fig3b-通过ITM23，HSP60来说明，NLRX1敲除后，线粒体自噬得到了抑制，因为那几个蛋白都没什么变化。

Fig3c-使用TMRM（判断线粒体膜电位的指标）来说明了，NLRx1敲除后，线粒体膜电位下降得很厉害。

Fig3de-电镜数据，说明了NLRX1敲除后，被溶酶体吞噬的线粒体数量下降，这说明NLRX1参与了线粒体自噬的过程。

Fig3fg-恢复实现。向NLRX1敲除的PM中转入NLRX1-dLIR和NLRX1-WT后，WT可以恢复LM诱导的自噬。作者提到了附图中的数据，即NLRX1缺陷的PM会部分阻断CCCP诱导的线粒体自噬，这可能是因为CCCP是一种广谱线粒体自噬诱导剂（它还诱导PINK1-Parkin通路），而LM并不会激活PINK1-Parkin通路。

前人研究指出，NLRX1在VSV感染过程中参与常规自噬。NLRX1的缺陷会阻断VSV诱导IC3I向LC3II转化，但是在NLRX1敲除的PM中，LM却能诱导LC3I向LC3II转化，并且有所升高，这可能是因为线粒体自噬缺陷导致的，因为CQ（氯喹，溶酶体抑制剂）处理后的PM也未观察到这种缺陷导致的LC3II升高。基础水平以及饥饿处理的NLRX1缺陷的PM也不会出现自噬以及LC3II的改变，这说明NLRX1并不参与基础水平或饥饿诱导的自噬。fig3的数据说明，NLRX1是一个新的LC3受体，它参与LM和CCCP诱导的线粒体自噬。

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Fig4a-NLRX1敲除后，pM中LM含量下降，这说明LM可能会胁持宿主细胞的线粒体自噬来促进自身的生存。

Fig4bc-使用Mdivi-1(一种线粒体融合抑制剂)后，细胞中Lm含量下降，因此抑制了线粒体融合，也就是相当于抑制了线粒体的自噬。而使用了CCCP（这是促进线粒体自噬的诱发剂）后，细胞中LM升高。Bc的数据说明了，线粒体自噬增强，LM减少，反之，LM减少。

Mdivi-1是一个具有选择性和细胞穿膜性的线粒体分裂抑制剂，抑制了DRP1（发动蛋白相关GTP酶）和Dynamin ，这是一个可以穿越细胞膜的喹唑酮类化合物，抑制了酵母的Dnm1和人源的Drp1分裂DRPs(发动蛋白相关GTP酶)，并且高效可逆的诱导线粒体融合进一个巢样的结构。细胞外的研究表明mdivi-1通过变构调节阻断了Dnm1的ATP酶活性(IC50<10μM)和自组装。在HeLa细胞和细胞外鼠源肝细胞线粒体配置液中，Mdivi-1有效地分别抑制了STS和C8-Bid诱导的MOMP（线粒体外膜通透性增加）。在细胞中，mdivi-1通过抑制线粒体外膜通透性进一步的抑制了细胞凋亡。大体上，mivi-1代表了一类治疗中风，心肌梗死和神经退行性疾病的疗法

Fig4d-在体实验。

Fig4e-死亡曲线

Fig4f-使用了Mdivi-1抑制剂后的在体数据

Fig4f-使用了CCCP（促进线粒体自噬）后的在体数据

Fig4hi-使NLRX1小鼠与WT小鼠使用了Mdivi-1后的数据，无差异。

Fig4j-使用大肠杆菌（胞外菌）感染NLRX1敲除小鼠，无差异，说明，NRLX1只是参与了胞内菌诱导的线粒体自噬。

Fig4k-骨髓移植实验。WT与NLRX1敲除鼠的骨髓。可以发现，表型一致。

Fig4lm-巨噬细胞条件性敲除鼠。表型与全敲鼠一致。

Fig4的数据表明了，LM通过NLRX1诱导线粒体自噬，在巨噬细胞感染LM的过程中参与了重要作用。接着，作者研究了线粒体自噬是如何影响LM存活的。

Fig5a-线粒体的活性氧基基团（mtROS）在控制胞内菌，例如沙门氏菌方面有着重要的作用，线粒体损伤的积累伴随着更高水平的mtROS的产生。作者先检测了在Nlrx1-/-敲除的巨噬细胞杀菌能力的增强是否与异常的mtROS产生有关。MitoSOX是一个纵横特异性ROS指示剂，作者发现在Nlrx1-/-敲除的巨噬细胞中，经Lm感染后，mtROS的水平胆显升高。

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Fig5b-使用Mdivi-1，同时使用CCCP，能够抑制由LM诱导的ROS产生（这是为了说明，抑制自噬能够抑制Lm诱导的ROS）。

Fig5c,d,e,f-经MitoTEMPO处理后（MitoTEMPO是一种靶向线粒体的抗氧化剂，它可以抑制活性氧对线粒体的损伤。），NLRX1缺陷，或者是Mdivi-1处理的体内实验与体外实验说明，LM的增殖会降低。

Fig5,h-经Lm感染后，Nlrx1-/-PMs的线粒体电位降低，mtROS的产生增强。

Fig5ij-Mdivi-1也能增强Lm诱导的THP-1巨噬细胞的mtROS的增强。

这些数据都表明，Lm能通过NLRX1诱导巨噬细胞中线粒体自噬，移除受损的线粒体，因此降低mtROS的产生，有利于Lm的存活。

虽然NLRX1有报道过参与病理性感染，但是它的功能机制还不清楚。一些研究指出，NLRX1能负向调节TLR与病毒介导的NF-kappaB活性，以及IFN-I的产生，但是其抑制效应还未见报道。作者发现在NLRX1缺陷的巨噬细胞中，Lm诱导的NFkappaB活化以及下游的基因表达，以及分泌的炎症因子不受影响。在Nlrx1缺陷的巨噬细胞和野生型巨噬细胞中，Ifnb基因的表达也有所不同。虽然mtROS有报道说是能激活NLRP3，用于IL-1beta的分泌，作者发现，NRLX1缺陷不影响Lm诱导的IL-1beta的分泌，这与报道称AIM2炎性小体参与LM诱导的IL-1beta的分泌是一致的。因此，作者的数据指出，mtROS在抑制Nlrx1缺陷的巨噬细胞中的LM的增殖有着重要作用。经典的自噬对于自噬小体的形成有着重要意义，它能降解包裹的东西，例如线粒体。作者接着研究了经典自噬通路相关的蛋白是否参与了Lm诱导的线粒体自噬。

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经典的自噬（Canonical

autophagy）对于自噬小体的形成有着重要意义，它能降解包裹的东西，例如线粒体。作者接着研究了经典自噬通路相关的蛋白是否参与了Lm诱导的线粒体自噬。

Fig6ab-在Atg7缺陷的巨噬细胞中，Lm与CCCP能诱导mtDNA水平的下降会被阻断，以及线粒体蛋白的下降也会被阻断（也就是说，Lm与CCCP原来能诱导mtDNA水平的下降，这表明出现了线粒体自噬，而在Atg7缺陷的巨噬缓解中，这种下降被抑制了，说明了自噬出现了障碍）。

Fig6cd-在敲低了Atg5的小鼠PM中，也能出现上述的现象。

Fig6ef-在敲低了其它的自噬相关蛋白，例如Becn1，Rb1cc1与Atg15的巨噬细胞中，这种现象也有。

Fig6gh-在THP1这种人源细胞中，敲低了ATG7后，这种现象也有。

Fig6ij-所有的这些数据都表明，经典自噬对于Lm诱导的线粒体自噬来说有着重要的作用。与野生型细胞相比，在敲除了Atg7的细胞中，与在Nlrx1缺陷的巨噬细胞中类似，Lm诱导的线粒体损伤与mtROS的产生会升高。

Fig6kl-同样的，在Atg7缺陷的PM，Mdivi-1，CCCP对Lm增殖的影响会受到抑制。

这些数据都说明了，Lm会胁持宿主细胞的自噬机体，诱导宿主细胞的线粒体自噬，促进其自身存活。

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为了研究Lm的哪个成分参与了线粒体自噬，作者首先研究了Lm来源的DNA和RNA，发现它们都无法诱导巨噬细胞的线粒体自噬。但是，杀死（用热源杀死）的LM也无法诱导巨噬细胞的线粒体自噬。这说明LM中有一些成分是是热敏感的，这一成分与诱导线粒体自噬有关。LLO是LM的一个毒力因子，它在LM感染的不同阶段发挥作用。

Fig7abc-体外实验发现，LLO能诱导巨噬细胞的线粒体自噬与线粒体损伤。

Fig7def-使用了LLO缺陷的LM（Δhly）与野生型LM来诱导巨噬细胞，Δhly无法诱导巨噬的线粒体自噬与线粒体损伤。

Fig7gh-为了进一步确定LLO是诱导巨噬细胞线粒体自噬的主要因子，作者还使用了另外一种缺陷株，即ΔprfA（DP-L4317），这种缺陷型LM没有PrfA基因，它是Lm编码LLO与ActA的转录激活因子，还使用了另外一种Lm缺陷株，即DP-L6173，这种缺陷株缺陷PrfA，但是能产生LLO。DP-L4317无法诱导线粒体自噬，而DP-L6173能诱导与野生型Lm类似的线粒体自噬。因此，作者认为，LLO是LM诱导线粒体自噬的主要因子。

Fig7ij-接着，作者研究了NLRX1是否参与了LLO诱导的线粒体自噬。LLO诱导的mtDNA的下降在Nlrx1缺陷的PM中能被阻断，而线诱导的线粒体损伤则有所增加。

Fig7k-此外，LLO缺陷型Lm无法诱导线粒体自噬，而补充了LLO的缺陷Lm则能诱导NRX1依赖的线粒体自噬。

Fig7l-经LLO刺激后，Nlrx1缺陷的PM线粒体电位降低，mtROS升高。以前有文献报道过，Δhly缺陷的巨噬细胞能在小鼠巨噬细胞系J774中稍微增殖。

Fig7m-作者在附件中也提到了Δhly缺陷型菌株在小鼠的PM中有所增殖。但是，Δhly菌株的在感染了6小时后，细菌含量升高了5倍。因为有报道指出，在人上皮细胞中，Δhly缺陷的Lm会表达phospholipase C与metalloprotease，用于补偿LLO，使Lm在细胞中增殖。因此，Δhly缺陷型Lm也有可能使用类似的机制在小鼠的PM中增殖。为了研究细胞外LLO能否影响入侵后Lm的增殖，作者增加了Δhly的MOI（使之与野生型Lm进入细胞中的数量类似）。作者发现，LLO缺陷的Lm能抑制Lm的存活，而加入LLO与Δhly则能增加Lm的含量。这说明，Lm分泌的LLO诱导了宿主细胞的线粒体自噬，增强了Lm在细胞中的存活。

Fig7no-在NLRX1缺陷的巨噬细胞中，Δhly菌株的滴度并不受影响。

Supplementary6n-由于无法移除由线粒体自噬导致的受损的线粒体，因此Δhly突变株在野生型PM中会产生更多的mtROS，但在NLRX1缺陷的PM中，野生型LM与Δhly缺陷的LM则无此现象。

附件Fig7abc-作者接下来研究了LLO诱导线粒体自噬的机制。LLO会在细胞膜上形成孔洞，诱导离子流，这些离子就包括钙离子，钾离子。作者假设，异常的离子流会诱导线粒体的损伤。途径发现，BAPTA-AM（一种钙离子螯合剂，它进入细胞后，会水解成为BAPTA，从而与Ca2+发生复杂反应，可以有效地减少胞内游离钙离子的浓度. 线粒体是平衡细胞内钙离子平衡稳态的重要细胞器,另外,胞内钙离子累积可造成线粒体功能障碍或紊乱引起线粒体凋亡通路的激活）能显著阻断由LLO诱导的线粒体损伤与线粒体自噬，而通过使用一个含有高浓度氯化钾的培养基（90mM）则能阻断氯化钾，就无此效应的出现。

我们接着来研究了LLO诱导的钙离子流是如何导致线粒体损伤的。当细胞内钙离子水平太高时，线粒体就会摄取并储存钙离子，这一过程主要是通过线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter，MCU)。由于钙离子在线粒体中的积累会导致线粒体膜被阳离子诱导的损耗，作者假设，观察到的线粒体损伤有可能是由于线粒体通过MCU摄取了钙离子导致的。在附件中，作者提到了使用siRNA干扰了MUC后，LLO诱导的线粒体损伤与线粒体自噬就会受到抑制。这些结果都说明了，LLLO通过MCU诱发钙离子内流，并导致了线粒体的损伤。由于LLO能够诱导巨噬细胞中的线粒体自噬，但无法诱导上皮细胞的线粒体自噬，因此作者怀疑LLO的不同效应是否是由于NLRX1在这些细胞中的表达差异造成的。作者发现，NLRX1在上皮细胞中表达量很低，在巨噬细胞中表达量比较高。然后作者在Hela中高表达了全长了NLRX1，使之表达量与巨噬细胞中的类似，此时，过表达了NLRX1的Hela能够被LLO诱导线粒体自噬。但是，作者还注意到，在这种Hela细胞被LLO诱导的线粒体自噬应答仍然比巨噬细胞低。这说明在上皮细胞中，除了NLRX1过表达导致的线粒体自噬外，还有其他的机制参与了其中。

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Fig8a-NLRC4和NLRP3是研究得最多的NLR家族成员，它们含有一个LRR结构域，参与自身抑制，当刺激后，它们会出现寡聚化。使用Lm以及LLO刺激时，氷会诱导NLRX1的寡聚化。CL：glutaraldehyde，戊二醛在研究某个蛋白寡聚化的时候，通常使用戊二醛进行交联。

Fig8b-NLRC4的C末端LRR结构域会与中心的naCHT结构域结合，维持一种单分子形式的自我抑制状态，有文献报告过一种NLRC4的突变体，此突变体缺乏LRR结构域，它们会导致NLRC4持续的寡聚化，诱导下游信息转导。类似的，我们观察到，NLRX1-dLRR能持续地形成寡聚体。

Fig8cd-当用LLO或LM刺激时，它们并不会进一步地强化。这说明，LLO与LM这两种处理并不诱导由LRR结构域介导的抑制状态。与寡聚化诱导的活化类似，作者发现，NLRX1-dLRR能持续地诱导线粒体自噬（需要LIR模序）。

这些结果暗示，释放由LRR结构域介导的NLRX1抑制是诱导线粒体自噬产生的必要条件。接下来，作者研究了靶向作用于另外一种细胞器（由靶向NLRX1转到ER）是否能够诱导另外一种选择自噬。FAM134B是ER吞噬受体，它含有一个网状结构域，此结构域参与ER的定位。作者使用了一个嵌合蛋白，即将FAM134B的网状结构域与NLRX1融合起来，研究作者的这种假设。

作者首先构建了一个NLRX1线粒体定位的突变体（dmt-NLRX1），然后将网状结构域与dmt-NLRX1进行融合（ret-dmt-NLRX1),dmt-NLRX1-dLRR(ret-dmt-NLRX1-dLRR)和dmt-NLRX1-dLRR-dLIR(ret-dmt-NLRX1-dLRR-dLIR)，作者发现这三个嵌合蛋白能与ER标记特CLIMP-63共定位。ret-dmt-NLRX1-dLRR则能出现更强的寡聚化，与LC3共定位，诱导CLIMP-63的降解，此过程可以被CQ阻断，这说明，dmt-NLRX1-dLRR定位到ER上，能诱导ER的自噬。总之，这些附件中的数据说明，NLRX1如果没有LRR结构域，则能充分促进自噬。

fig8ef-作者随后研究了LRR结构域弯曲后与NACHT结构域的结合能够维持NLRX1的一种自我抑制状态。作者实际上观察到了LRR结构域与NACHT结构域结合，并维持了NLRX1-dLRR的寡聚化。

Fig8g-NLRX1的LRR结构域能抑制由Lm或LLO诱导的NLRX1的寡聚化。

Fig8hij-NLRX1的寡聚化能诱导下游信号转导，LRR结构域能抑制NLRX1-dLRR与LC3的结合，以及线粒体自噬。

Fig8k-作者又进一步发现，由LM或LLO触发的，由内源的NLRX1介导的自噬能被LRR结构域抑制。

上述的这些发现共同说明，NLRX1的LRR结构域与NACHT结构域的结合能维持一种自我抑制状态，LM与LLO能诱导LRR结构域介导的抑制，因此诱导NLRX1寡聚化，使它的LIR模序与LC结合，诱导线粒体自噬。