细胞永生化的构建方法

细胞永生化介绍

细胞永生化在近年间逐渐成为了细胞研究领域的重要方向。研究发现，细胞永生化不仅可以进一步了解细胞周期运转规律，明确细胞衰老与凋亡的分子机制，而且对探索癌症的发生机制以及解决肿瘤治疗等方面的问题都有着重要意义。

细胞永生化（Cell immortalization）是指细胞在体外培养的时候，由于自身基因改变或者外界因素刺激，例如细胞周期检查点通路受损、端粒酶的再次激活上调、原癌基因激活等影响，使细胞分裂加快，并突破了自我衰老与凋亡机制，从而实现了无限增殖，可以进行长期传代培养。

正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡。而细胞培养是一项基本的科研技术，无论是基础的科学研究，还是在临床治疗，以及生物工程制药，疫苗研发等方面，都发挥着重要的作用。

细胞永生化的构建方法

第一种是激活端粒酶延长端粒长度，从而使细胞获得持续增殖的能力。端粒是存在于真核细胞内染色体首尾末端，由简单重复的DNA序列和周围蛋白质构成的特有帽状结构，具有维持染色体结构和位置的稳定，防止染色体被化学酶降解，调节细胞正常功能和决定细胞寿命等重要的生理功能。正常动物细胞的端粒随着细胞不断分裂会持续丢失，当缩短到一定长度时细胞将停止分裂并走向衰老进程。

端粒酶是一种核糖核蛋白，具有逆转录酶活性，以自身RNA为模板合成端粒重复序列，以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，从而维持端粒的长度，使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡。

（A）DNA复制留下不能完全复制的3’末端端粒DNA；（B）端粒酶已自身RNA为模版延长端粒DNA已完成复制；（C）蓝色标记的细胞染色体和黄色标记的端粒。

端粒酶由三部分组成：端粒酶RNA（telomeraseRNA，TR或TRC）模板、端粒酶相关蛋白（TPI）和端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase，TERT）。TERT作为端粒酶的催化亚单位和限速酶，其表达水平高低决定端粒酶活性。正常情况下，大多数体细胞端粒酶的表达是严格调控的，表达是瞬时和低水平的。在原代细胞中稳定表达hTERT能有效激活目的细胞端粒酶，维持端粒长度，使细胞易于永生化。

TERT介导的永生化细胞是正常细胞，它保持了正常细胞的生理特性，具有正常的生长速率，正常的核型，呈现生长锚着依赖性和接触生长抑制性，不具有致癌作用和软琼脂生长能力，是一种非常理想的细胞来源。虽然激活端粒酶活性能够使多种人和动物的细胞永生化，但是对于有些细胞，重建端粒酶活性并不足以使细胞永生化，还需要借助癌基因或病毒基因。

第二种是多种抑癌基因（如p53, pRb, BRCA1, DPC4等）通过等位基因隐性作用、抑癌基因的显性负作用等阻止细胞老化途径。将一些病毒基因（如SV40，HPV等）导入目的细胞核内可以改变正常基因，使部分细胞得到无限增殖的能力，达到永生化的状态。如导入SV40，则细胞抑癌基因p53和pRb会与SV40中的LT抗原片段相关结合区域结合，使抑癌基因失效无法表达，从而防止细胞分裂停滞，使其无限增殖。

由于细胞的来源、组织不同，其细胞的增殖、分化调控也不尽相同，因此，每类细胞永生化细胞的方法也不同，目前，较为常用的方法是通过慢病毒、逆转录病毒或virusfree技术在原代细胞中稳定持续表达SV40或 hTERT从而实现原代细胞永生化。当SV40或 hTERT导入细胞后，可以借助抗性基因添加相应药物筛选出阳性细胞，随后观察细胞形态以及增殖情况。如果细胞可以持续的分裂且类型未发生转化，即可认为永生化成功。

细胞永生化的应用价值及意义

1. 永生化细胞稳定均一，性状一致，是体外研究增殖、分化、凋亡、衰老等生物学过程的理想模型

2. 可使得传代困难，增殖困难、易衰老的细胞获得永生，并且永生化的细胞壁原代细胞易于培养，因为它们生长能力更强可以获得更多的细胞资源，也节省了分离细胞的周期，降低反复分离原代细胞的成本

3. 永生化的下拨和肿瘤细胞密切相关，是研究肿瘤发生机制的重要细胞模型

4. 永生化细胞可建立稳定的细胞库，遗传相同的种群，有助于提供一致且可复制的实验结果。