DEAE Sephadex A-25的使用方法及注意事项

DEAE Sephadex A-25的使用方法及注意事项

本文转自生化试剂。

产品简介

DEAE Sephadex A-25是以交联葡聚糖为基质的弱阴离子交换剂，适合批量进行分离层析，具有很好的结合能力。葡聚糖离子交换剂是将功能基团通过醚键偶联到交联葡聚糖上。根据配基基团不同分为：DEAE、QAE和CM 3种，分别包括两种不同的孔径：A-25/C-25和A-50/C-50。

产品参数

产品名称：DEAESephadex A-25

货号：17-0170-02

基质：交联葡聚糖

颗粒大小：40-120μm

配基：二乙胺乙基

离子容量：3-4mmol/g

每毫升蛋白载量：HSA-30mg；α-乳白蛋白-140mg

最大流速：45cm/h

工作pH：2-9；2-13（在位清洗）

化学稳定性：在水溶液中稳定例如：8M 尿素和6M盐酸胍溶液

操作温度：室温

保存条件：4-30°C(干粉)；4-8°C（用过的柱子，保存在20%乙醇或者0.01M NaOH）

实验步骤

1.预处理

称取所需质量的DEAE Sephadex A-25干粉，溶于缓冲溶液中；不同缓冲溶液凝胶的膨胀系数不一样。一般1g DEAESephadex A-25溶于25mL的盐溶液中。选择后续实验相同的pH的缓冲液进行溶胀。室温溶胀一般需要2天，沸水浴溶胀一般需要2小时，同时还能够排除溶胶中的气泡。磁力搅拌时应注意不要破环凝胶颗粒。用布氏漏斗进行冲洗，使其保存在初始的缓冲液中。按凝胶：缓冲液=3:1比例配成匀浆。

2.装柱

（1）平衡所有试剂和填料平衡至室温。

（2）将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

（3）将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液体（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。

（4）用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意不要使用气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

（5）打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2-3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。

3.平衡

让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。

4.上样

（1）样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心、过滤后上柱；

（2）一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡洗液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。

5.洗脱

对于DEAE Sephadex A-25一般使用增大盐离子浓度或者降低pH的连续或者梯度洗脱。

6.再生

一般用高盐浓度的缓冲液（1-2M NaCl）冲洗，洗10倍以上柱体积，接着用结合蛋白的平衡液洗到平衡，可再次使用。若有失活的蛋白或者脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗（CIP）除去。

7.在位清洗

（1）对于以离子键结合上去的蛋白，可以用0.5-1柱床体积的2M NaCl去除。

（2）对沉淀蛋白、以疏水作用结合的蛋白或者脂类物质，可用1柱床体积的0.1M NaOH去除。

（3）对强疏水性结合的蛋白、脂类等，可用4-10倍柱体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，但要注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡。清洗完毕后，用至少3倍柱体积缓冲液平衡柱子。

注意事项

（1）用过的柱子密封贮存于4°C（保存溶液为20%乙醇或者0.01 M NaOH），通风、干燥的地方，不能冷冻。

（2）在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。