单细胞Fixed RNA采用4%的多聚甲醛（PFA）对细胞进行固定，可锁定RNA的表达状态， 解决了单细胞样本储存、多样本批量处理以及混样测序的问题，让单细胞转录组的研究更加灵活，随心所欲！本次，就对这些问题进行汇总和解答，以帮助大家进一步了解单细胞Fixed RNA~
采用PFA对细胞进行固定，锁定RNA表达状态。建库时将样本与探针进行杂交，捕获基因用于制备单细胞测序文库并开展测序，然后使用10x Genomics的Cell Ranger和Loupe Browser软件工具进行分析。
图1 单细胞Fixed RNA工作流程（图片引自10x Genomics官方）
4％的PFA溶液是免疫组织化学和培养细胞固定中最常用的固定液之一，它能较好的保护组织和细胞的形态结构以及核酸状态。新鲜组织解离生成高活性的单细胞悬液，通过PFA固定细胞，可以用于一定时间的储存和运输，而不影响细胞组分和RNA的表达状态，为单细胞转录组的研究提供便利。
图2 用PFA固定RNA的表达状态示意图（图片引自10x Genomics官方）
通过Fixed RNA处理的样本，建库时需要与探针杂交捕获基因再进行后续操作。Fixed RNA配套的杂交探针包含区分样本来源的Barcodes，每个样本与不同的探针进行杂交，使每个样本带上特有的Barcodes。数据分析时可通过识别不同的Barcodes将不同样本来源的Reads区分开来。Fixed RNA配套芯片有8个通道，每个通道最多可以混16个样本。
图3 单细胞Fixed RNA捕获探针结构示例图（图片引自10x Genomics官方）
由于需要捕获探针捕获基因进行建库 ，因此需要有配套的探针的物种才可以开展实验。目前单细胞Fixed RNA仅适用于人（小鼠后期会推出）。冻存细胞、细胞系、原代细胞悬液、细胞核悬液、新鲜组织等样本类型都可适用。为了确保实验的成功率和稳定性，小贝壳儿优先推荐容易解离的组织类型，如外周血、肺、肠、脾脏、肾、胸腺、肝脏、胚胎培养细胞、细胞系等。
图4 单细胞Fixed RNA适用物种及样本类型（图片引自10x Genomics官方）
操作步骤更加简单易行，仅需多聚甲醛固定，操作简单，改进样本采集、制备和处理流程；
样本采集更加灵活，固定样本生物学状态，便于样本存储运输，将样本采集扩展到多个采集点的样本，缓解单细胞样本采集的限制；
打破脆弱样本、珍贵样本的限制，锁定脆弱细胞或快速变化细胞生物学状态，将实验范围扩展到脆弱或濒死细胞、细胞状态可能不断变化以及珍贵样本；
优于或与常规单细胞转录组相当的分析结果，数据表现优良，关键有效数据量、基因表达量、分群结果与常规单细胞表现一致，且可提高低表达基因的检出率；
百万级细胞的高通量，混样降低实验成本，单通道中最多可混16个样品，单张芯片最多可混128个样本，最多可得1,024,000个细胞，混样大大降低实验成本；
减少生产试验的批次效应，样本固定后集中处理，在同一次运行中批量操作实验和分析，最大限度减少实验可变性。
Fixed RNA可以解决单细胞样本储存、多样本批量处理以及混样测序的问题，主要解决单细胞研究的样本制备时，无法保证新鲜组织及时开展单细胞建库实验的问题。应用场景如下：
多时间点取样的样本，项目设计需考虑不同时间点取样，如病例来源时间不可控、涉及不同用药时间变化、涉及不同发育时间点取样等，样本只能分批次采集，无法同批次实验造成批次效应；
多中心合作或需要长距离运输的样本，细胞或组织因为运输过程中的物理撞击或不适当的储存条件而失去活力；
样本需要先做病理分型导致无法保证样本的新鲜程度；
减样本本身细胞状态脆弱、细胞状态不断变化、易降解等。
目前可接收人的冻存细胞、细胞系、单细胞悬液、单细胞核悬液、血液和组织等样本类型，推荐送样量如下：
表1 单细胞Fixed RNA的送样量推荐
注：除冻存细胞外，其他样本要求均为新鲜样本
您可以在制备好单细胞悬液之后自行开展RNA固定的操作，并按合适的保存条件进行保存，待样本集齐后再一起将样本寄送至实验室进行建库和测序；也可以将样本寄送至实验室，进行单细胞悬液制备或单细胞核悬液制备、RNA固定和样本保存，待样本集齐后再一同进行建库。
推荐第二种方法，主要原因为单细胞悬液或单细胞核悬液制备完成后需要先进行样本质检，检测合格的样本才可进行RNA固定操作。质检过程中某些标准涉及到机器和实验人员的经验判断。
Fixed RNA处理进行建库测序过程中有两个安全停止点，即甲醛固定后和探针杂交后。在以上两个安全停止点上以及合理的保存时间内，待样本集齐后即可继续操作建库和开展后续实验。如需停止实验，建议在甲醛固定后停止并保存样本，待样本集齐后，再同批次进行探针杂交和建库实验。建议保存温度和时间见下表：
表2 甲醛固定后建议保存条件
注：建议最佳保存温度为-80°C，保存时间越短越好。
图5 Fixed RNA后不同保存条件的数据表现（图片引自10x Genomics官方）
左图：5种样本类型，2不同停止点保存，4种不同保存温度，3种不同保存时间，单细胞分析关键指标一致性高；右图：以PBMC为例，不同停止点保存，不同保存温度及保存时间，单细胞分析的分群结果一致性高。
Fixed RNA单细胞转录组：贝瑞基因推荐测序数据量至少为20K reads pairs/cell。
Fixed RNA采用探针捕获表达基因，探针对于基因捕获更加灵敏和高效，不需要过高测序深度即可较好的捕获基因并进行检测。从测试数据来看，同等数据量下，Fixed RNA与新鲜组织3´转录组的单细胞结果比较，两者在基因表达上高度一致，灵敏度上Fixed RNA优于3´转录组的单细胞结果，表明RNA的固定和探针捕获有利于提升低表达基因的检出率。
图6 RNA固定与新鲜组织单细胞转录组表达结果展示（图片引自10x Genomics官方）
10x Genomics官方做了测试，将样本进行RNA固定后保存不同时间（0d、7d和30d），然后进行单细胞转录组实验，数据结果显示，固定不同时间的样本分析得到的单细胞关键指标一致性非常高（见图7和图8）；相同组织分别进行RNA固定保存一段时间的单细胞转录组测序和新鲜组织做的3´单细胞转录组测序，数据结果显示，RNA固定的单细胞数据优于或与新鲜组织的单细胞数据相当（见图6和图9）；相同组织进行单样本单细胞转录组测序和混样模式下的单细胞转录组测序，将混样的数据拆分成单个样本的单细胞转录组数据之后与单样本单细胞转录组数据进行比较，结果显示两者一致性高（见图10）；同组织进行混样测序，拆分成单个样本的单细胞转录组数据之间进行比较，结果显示样本间间细胞类型一致性也很高（见图11）。由此可见，RNA固定不影响细胞分群、基因表达等单细胞测序的关键指标，且混样拆分也可以得到良好的单样本结果，数据可信度非常高。
Fixed RNA处理的样本最多可保存三个月。新鲜组织也可以在液氮中短期保存，待需要进行实验时（建议尽早进行实验，时间越短越好）开展抽核操作，制备成单细胞核悬液以进行后续实验操作。建议根据样本类型和研究目的选择采用哪种解决方案？
如存在以下情况，推荐选择冻存组织抽核的方案：
细胞类型过大或外形不规则，如神经元细胞、心肌细胞、脂肪细胞等；
难解离成单细胞悬液细胞的组织样本，如胰腺、皮肤、脂肪等；
已经冻存的组织样本。
2. 如存在以下情况，推荐选择Fixed RNA的方案：
想要混样降低建库测序成本；
关注整个细胞的RNA表达状态（包含细胞质中的RNA）；
担心不同批次实验导致批次效应；
关注某些低表达基因的检出；
样本本身细胞状态脆弱、细胞状态不断变化、易降解等。
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