生信小课堂
研究背景：
特发性肺纤维化(IPF)是一种尚未明确发表机制的肺病。近年来，IPF的发病率随时间增加。坏死性凋亡是一种促炎型的程序性细胞死亡，可促进细胞内容物的释放以激活免疫反应。近年来，免疫浸润一直是癌症研究领域的热点。多种免疫细胞在肺纤维化过程中起重要作用。
关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因。
2 单个疾病结合免疫浸润，热点基因集，机器学习算法等。
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析
5 单细胞结合普通转录组生信分析
目前非肿瘤生信发文的门槛较低，有需要的朋友欢迎交流
流程图：
研究结果：
一、IPF与对照间DEG和坏死性凋亡相关DEG（NRDEG）的鉴定
1、差异分析前对GSE110147中的IPF组和对照组进行主成分分析(PCA)，发现两组之间具有明显的可比性。
2、图2A描绘了PCA的结果。随后，通过差异分析发现GSE110147中IPF和对照组之间有3253个DEGs。
3、图2B通过热图的可视化显示了DEGs的表达。坏死性凋亡相关基因与GSE110147中的DEGs重叠，进一步分析29个重叠的NRDEGs。
4、图2C以维恩图显示29个NRDEGs。
5、通过热图和火山图来显示NRDEGs的表达，如图2D, E。
二、PPI网络及功能通路分析
1、从STRING数据库构建NRDEGs的PPI网络(图3A)。
2、基于CytoHubba MCC的算法被用来识别前10个枢纽基因(图3B)，包括CFLAR、BIRC2、BIRC3、CYLD、TRAF5、IL1B、STAT1、INFAR1、TICAM1和NLRP3。
3、对NRDEGs进行GO和KEGG富集分析，确定其生物学功能和相关信号通路(图4A、B)。
4、在分子功能中也发现了肿瘤坏死因子受体超家族结合、参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性和细胞因子受体结合的富集(图4C)。
5、KEGG分析显示，NRDEGs富集于坏死性凋亡NOD样受体信号通路、TNF信号通路、甲型流感、新型冠状病毒肺炎、单纯疱疹病毒1型感染、脂质和动脉粥样硬化、C型凝集素受体信号通路、丙型肝炎(图4D)。
三、免疫浸润及NRDEGs与免疫细胞的相关性
1、通过富集分析，观察到NRDEGs主要与免疫相关信号通路相关。
2、利用ImmuCellAI算法研究了IPF中程序性坏死和免疫浸润之间的关系。结果显示IPF组和对照组之间有12种免疫细胞类型存在显著差异(图5A-D)。
3、spearman相关性检验结果显示，NRDEGs主要与巨噬细胞和中性粒细胞浸润呈正相关，与DC细胞和NK细胞浸润呈负相关，通过相关热图可以直观显示(图5E)。
四、研究NRDEGs在肺纤维II型肺泡上皮细胞中的表达
1、为了进一步探索IPF中程序性坏死与细胞类型的关系，提取了GSE122960的单细胞测序数据进行分析。
2、在AT II中观察到4831个差异表达基因。筛选出31个重叠的NRDEGs，包括MLKL、IFNAR1和TRAF5。图6A显示了维恩图可视化中的31个NRDEGs。
3、通过火山图观察NRDEGs的表达情况，如图6B所示。
四、预后相关枢纽基因的鉴定及预后预测模型
1、GSE70866包含176例IPF患者的测序数据，sva包消除了批次效应。去除效果以PCA图表示(图7A, B)。
2、提取枢纽基因和预后数据的表达矩阵，KM曲线显示单因素Cox回归分析得到的生存差异基因(图7C-F)。
3、多因素cox回归显示IFNAR1、TRAF5、NLRP3、CYLD与预后相关。结果以森林图的形式显示(图8)。作者基于多因素cox回归的结果构建了预后模型
4、预后模型分析显示，与低危组相比，高危组的预后明显更差(图9A)。
5、该生存评估模型对IPF患者预后具有较好的预测价值，AUC为0.708(图9B)。
6、本研究还基于Cox模型建立了总生存预测列线图(图9C)。
五、NRDEGs表达及预后预测模型效果的验证
1、通过对GSE213001的分析，共发现27个相同的NRDEGs。27个NRDEGs中有12个基因的表达趋势与GSE110147一致，包括BIRC2、BIRC3、CYLD、DNM1L、HSP90AA1、IL1B、NLRP3、PLA2G4A、PLA2G4F、PYCARD、RBCK1和TRAF5(图10A、B)。
2、在外部数据集GSE93606中进一步验证了预后预测模型的效果。根据风险评分将IPF患者分为高危组和低危组。在GSE93606中，生存比较显示低危组的预后明显优于高危组(图10C)。
六、坏死性凋亡相关预后基因表达的初步验证IPF A549细胞模型
1、对以往肺纤维化单细胞测序数据集的分析表明，坏死性凋亡与AT II密切相关。
2、qPCR结果显示，CYLD、NLRP3、IFNAR1和TRAF5在TGF-b处理组中高表达，而在对照组中低表达。CYLD和TRAF5在对照组和IPF组之间的表达差异有统计学意义(图11)。
七、博莱霉素诱导肺纤维化小鼠模型预后基因表达的验证
1、为了进一步验证体外细胞实验结果，尽可能模拟肺纤维化患者的病理过程，成功构建了博莱霉素诱导肺纤维化小鼠模型进行体内实验。
2、Western blot结果显示，坏死标志物p-MLKL和4个与坏死相关的预后基因CYLD、NLRP3、TRAF5、IFNAR1在博来霉素诱导的小鼠肺组织中高表达(图12A、B)。
3、HE和Masson染色结果显示，与对照组相比，博来霉素组肺组织炎症和胶原沉积明显增加(图12C)。
总结：程序性坏死相关信号通路在IPF中大量富集。本文共筛选出29个NRDEGs，其中12个在GSE213001中表达趋势一致。Spearman相关性分析显示，NRDEGs表达与促炎免疫细胞浸润呈正相关，与抗炎免疫细胞浸润呈负相关。包括MLKL在内的NRDEGs在纤维化肺组织AT II中高表达。通过cox逐步回归构建4个NRDEG的坏死性凋亡相关预测模型。在验证数据集GSE93606中，预后预测模型显示出良好的适用性。程序性坏死在IPF中存在，并可能在ATII期发生。程序性坏死与免疫浸润相关，提示ATII程序性坏死可能通过激活免疫浸润和免疫应答参与IPF的发生。
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