前言——主要内容
这篇笔记是StatQuest系列笔记的第58节，主要内容是讲RNA-seq的原理。StatQuest系列教程的58到62节是协录组测序的内容。
RNA-seq研究的是什么
我们先来看一个案例，在下面的这个案例中，蓝色的细胞是一群正常的神经细胞，红色的细胞是一群突变的神经细胞。其中，突变的神经细胞表型与正常的神经细胞表型不同，此时，我们想知道，是什么遗传机制导致了这两群细胞表型的差异，这就意味着，我们要研究一下这两种细胞基因表达的差异，如下所示：
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接下来，我们就来看一下，怎么找出这两群细胞基因表达的差异。
首先，根据高中的生物知识我就知道，一个细胞都有一群染色体（其数目因物种的不同而异），每条染色体上都有一些基因，在这些基因中，有些基因处于活跃状态，在下图中，这些活跃基因上面的波形图案表示这些基因mRNA的转录本，如下所示：
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但是，还有一些基因是不活跃的，如下所示：
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而高通量测序技术就能告诉我们，哪些基因是活跃的，以及它们的转录水平是多少，如下所示：
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那么我们就可以通过RNA-Seq技术检测一下正常细胞的基因表达，再检测一下突变细胞的基因表达，如下所示：
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然后我们比较一下这两种细胞基因表达的差异，如下所示：
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例如，在这个案例中，我们就可以发现，经过RNA-Seq检测后，基因1的转录水平在这两种细胞内是没有差异的，如下所示：
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但是，基因2的转录则有很大的差异，如下所示：
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基因3的转录水平也有差异，如下所示：
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RNA-Seq的步骤
RNA-Seq主要有三个步骤，分别是第一：建库；第二，测序；第三，数据分析，如下所示：
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第一步：建库
在这一步，我们就以Illumina的实验流程和测序仪为标准进行讲解，其他公司的流程和测序仪可能略有出入，如下所示：
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建库又分这些步骤：
第一步，提取RNA；
第二步，将RNA打断成小的片段，打断的目的主要是因为RNA的长度有几千个碱基，而测序仪的读长只有200到300个bp，因此要进行打断，如下所示：
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第三步，将RNA反转录为DNA，这一步的目的在于，双链DNA比RNA更加稳定，双链DNA更容易扩增与修饰，如下所示：
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第四步，添加接头。接头主要发挥两个作用，第一，使测序仪识别加了接头的片段，因为接头上的序列与测序仪芯片上序列互补；第二，添加接头可以在一次测序中区分不同的样本，因为不同的样本可以使用不同的接头，如下所示：
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但我们需要注意的是，在加接头这个步骤中，它的效率并不是100%的，有些片段并不会被加上接头，如下所示：
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第五步：PCR扩增，这一步的扩增引物是接头上序列，只有那些加上了接头的序列才能扩增，如下所示：
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第六步：质控。这一步主要是看两个指标：第一，确定文库的浓度，第二，确定文库的长度。确定文库的浓度方法就是（根据我们实验室自己的流程），用Qubit检测一下文库的浓度，这个浓度比较粗略，不能当成精确的数值，接着，使用qPCR的方法，对文库进行绝对定量，经过qPCR绝对定量方法得到的文库浓度才是最终的文库浓度。在确定文库片段的长度方面，通常是使用Agilent 2100进行检测，如下所示：
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第二步：测序
测序测的其实就是文库，我们假设DNA片段的序列是下图的左侧部分，它是垂直的，因为在测序仪的芯片上，文库就是垂直排列的，在测序芯片上的一个小方格（grid）中将近有4亿条这样的序列，为了方便讲解，我们在下图的右侧只列出4条这样的序列，这样的一个小方格被称为flowcell，如下所示：
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下图是一个flowcell：
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在测序仪所使用的测序试剂中，含有一些特殊的碱基，这些碱基带有荧光探针，这些荧光探针按其结合碱基的不同，其颜色也不同，当测序仪开始测序时，这些带有荧光探针的碱基就会结合到DNA片段上第1个碱基，如下所示：
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一旦这些带有荧光探针的碱基结合到DNA片段的碱基上，此时测序仪就会拍下一张照片，如果从上往下看，就是下图中红框所示的图片，这张图片会告诉测序仪，左下角的碱基是A，如下所示：
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右下角的碱基就是G，如下所示：
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左上角与右上角的碱基就是C，如下所示：
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拍照结束后，测序仪会把这些这些碱基上的探针给冲走（测序试剂中有其他的成分，可以切掉这些荧光探针），此时，这些携带有探针的碱基就成了普通碱基，如下所示：
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然后再加入含有荧光探针的碱基，再次与片段结合，如下所示：
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在第二次结合后，测序仪会拍照，从上往下看，就是下图红框内的图片，如下所示：
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这样测序仪就知道，左下角的碱基是C，如下所示：
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右下角的碱基是G，如下所示：
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左上与右上的碱基是T，如下所示：
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第2张图片识别后，再次用试剂切掉这些碱基上的荧光探针，并冲走，如下所示：
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再进行第3次反应，如下所示：
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总之，测序仪会不断地循环这个过程，直到测完所有的碱基，如下所示：
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不过在实际的测序过程，这些DNA链的密度非常大，构成了一个密度极高的颜色矩阵，这个过程中也会产生一些问题，在下面我们就用一个简单的矩阵来说明这个问题，如下所示：
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有时候，一个荧光探针的亮度可能不够，此时测序仪就没有足够的把握能够识别这种颜色，而在测序的过程中，根据这些探针的亮度，会生成一个质量评分（Quality score），这个质量评分反映了测序仪对这个颜色识别的可信程度，像在下面的这个图片中，这个比较暗的点可能就会得到一个比较低的质量评分，如下所示：
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还有另外一种情况可能会得到一个质量评分，就是在某个区域内，相同的碱基数目太多，都呈现出一种颜色，如下图绿框所示部分，这种现象称为多样性差（low diversity），这种情况下，由于存在着大量的单一荧光，测序仪很难识别单独的碱基，这些颜色会混到一起。当测序仪测序时，对于文库中前几个碱基的识别很容易出现多样性差的问题，这是因为在刚开始的时候，测序仪要识别DNA片段位于芯片上的位置时，如下所示：
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我们看一下测序后的原始数据，下图是测序的一个read的信息，它由4行构成，如下所示
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第1行通常是由@开头的，它对于每条read，它都有唯一的ID，如下所示；
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第2行是测序的文库片段的碱基序列，如下所示：
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第3行是一个加号，它通常是空的，如下所示：
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第4行是质量信息，它用一个字符表示这个字符对应的碱基的质量评分，如下所示：
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一次测序通常有4亿条reads数，一共会产生16亿行信息，如下所示：
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数据预处理
我们现在已经知道了原始数据，以及原始数据如何产生的，那么我们下面要做这三件事情：
第一， 过滤掉垃圾reads；
第二，将高质量的reads比对到基因组上；
第三，对每个基因的reads数进行统计，如下所示：
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过滤垃圾reads
垃圾reads是指：第一，某些reads的碱基质量低；第二，这些reads是明显的结合错误（第二种低质量的reads我不太清楚，原文我也看不太懂，我个人理解就是两个接头直接连接在一起的read）。
一条典型的read是一个DNA片段加上两个接头，但是在某些情况下，两个接头会直接加在一起，这就是垃圾reads，如下所示：
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将read比对到基因组
我们先看一下基因组上的碱基序列，由于基因组的碱基序列很长，我们只截取一段出来，如下图中的红框所示，把这条基因组的碱基打断，会生成这些短的碱基序列，如下所示：
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此时，我们把基因组的这些片段加上索引，并记录下它们在染色体上的位置，就是下图蓝框中的部分，如下所示：
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此时，我们把我们的测序read也打成小片段，就像上面的基因组打成小片段一样，如下所示：
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然后把reads的小片段与基因组的小片段进行匹配，如下所示：
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那些与reads的小片段匹配的基因组小片段就是这些read小片段在基因组上的位置（哪条染色体上，染色体的哪个位置），如下所示：
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此时，我们可能有一个问题，为什么要把这些序列打断成小片段，这是因为即使reads与参考基因组在不是特别精确匹配的情况下，也能进行匹配，如下所示：
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我们来看一个简单的例子，在下图中，某条read最左侧是A，而对应的基因组上并没有这个A（打个很简单的案例，我自己的基因组肯定与别人的基因组略有差异），如下所示：
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即使这个小片段无法与基因组上相匹配，那么其它的小片段还是能够匹配的，此时我们仍然可以找到这条read来源于基因组的哪个位置，如下所示：
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每个基因的reads计数
一旦我们知道了某条read的位置（也就是说知道了这条read在哪条染色体上，以及在染色体的哪个位置上），那么我们就可以看一下这条read是否能够落在某个基因的坐标中（或者是某些其它感兴趣的区域），例如在下图中，我们列出了Xkr4和Rp1这两个基因的坐标，如下所示：
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当我们统计了每个基因的reads数后，我们就会得到下面这样的矩阵，如下所示：
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第1列是基因名，在人类中，人类大概有20000个基因，因此这个矩阵的大概有2万行（下图中并没列完所有的基因），如下所示：
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剩余的几列是每个样本对应的基因的reads数，这里的样本数目大概是6到800个，如下所示：
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对于大部分的RNA-Seq来说，一个“样本”通常是一群细胞的平均值（通常是600万个细胞），一次实验，一般有3个正常的样本，3个疾病状态的样本，总共就是6个样本，如下所示：
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而对于单细胞测序（Single-cell RNA-Seq）来说，每个细胞就是一个样本，因此这个矩阵中会出现有几百个样本，例如800多个，如下所示：
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我们现在看某一行数据，如下所示，在这行数据中，我们可以看到每个样本中，每个特定基因的reads数，如下所示：
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如果这个矩阵是单细胞测序的数据，那么这个矩阵有2万行（基因数目），800多列（样本数），大概有1600万个数值，这是一个极大的矩阵，并且随着测序技术发展，所测样本数目的增多，这样的矩阵会越来越大，如下所示：
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在进行最终的数据分析之前，我们还要对数据进行均一化，这是因为每个样本比对到基因组上的reads数都不同，这可能是由于在测序时，有些样本的reads质量低，而另外某些样本的浓度略大，导致其总的reads数略高，如下所示：
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例如，在下图中，Sample 1有635个reads比对上了，而Sample 2则有1270个reads数比对上了，Sample 2是Sample 1的两倍。但是这无法说明，Sample 2转录的基因是Sample 1的2倍，相反，这只能说明，Sample 2中的低质量reads数少，它在测序时，被测序仪识别的荧光更多而已，如下所示：
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但是，我们发现，Sample 2中基因的reads数貌似是Sample 1中的基因reads数的2倍，如下所示：
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A2M基因也是如此，如下所示：
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因此，我们需要调整每个基因的reads数，从这样才能真正反映出不同样本中比对上的reads数之间的差异，如下所示：
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均一化最简单的方法就是在每个样本中，每个基因的reads数除以总的比对上的reads数，不过，还有其他更复杂的方法，如下所示：
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我们再回到最初的正常细胞与突变细胞的比较，我们先有了这两群细胞，如下所示：
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然后提取RNA，如下所示：
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随后，进行测序，比对，统计每个基因的reads数，然后均一化，如下所示：
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此时，开始数据处理。
第三步：数据处理
数据处理的第一步通常都是相同，那就是绘图，我们要记住，这个表达矩阵非常大，如下所示：
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如果每个样本只有2基因，那么绘图非常简单，如下所示：
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第1步：绘图
首先我们用XY来替代这两个基因，根据它们的表达水平来绘图，如下所示：
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但是，我们有2万个基因，如下所示：
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因此我们会用PCA或者是类似的方法来绘图，PCA能够降低坐标轴的数目（也就是把2万个基因对应的2万个坐标轴给降低到3个或2个），从而更加直观地表现数据，如下所示：
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下图是我们利用PCA绘制的图形，正常的细胞是wt，突变的 细胞是ko，其中正常的细胞集中在左下角，敲除的细胞集中在右下方，如下所示：
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从图中我们可以发现，这两类数据的差异主要体现在x轴上，如下所示：
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相反，Y轴的差异没那么大，如下所示：
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这就说明，wt组与ko组的差异主要集中于X轴，如下所示：
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但是，当我们进行下一步的分析时，就需要排除wt2这个样本了，如下所示：
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下图是单细胞测序的PCA图，如下所示：
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上面的不同颜色绘图依据是这些细胞行为的不同，绿色表示的是静止的细胞，橘黄色表示的是迁移到培养皿周围的细胞，如下所示：
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大多数橘黄色的细胞与绿色的细胞是不同的，但是在左侧绿色的细胞中，也有几个是橘黄色的细胞，这说明这几个细胞的表型与绿色细胞更接近，如下所示：
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如果我们想要研究上面两个大群细胞的差异，那么此时我们就要排除左下那几个橘黄色的细胞，如下所示：
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总之，在对数据绘图后，我们可以从中得到这些信息：
- 找到感兴趣的差异部分；
- 在进行下游的分析之前，应该排除哪些数据，如下所示：
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第2步：寻找差异基因
绘图后，我们就需要找到正常样本与突变样本有哪些差异表达基因，在分析差异基因时，通常使用R中的edgeR或DESeq2，它们通常以下图进行展示，如下所示：
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其中红色部分是正常样本与突变样本的差异基因，如下所示：
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中间的黑色部分是没有差异的基因，如下所示：
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其中X轴表示的是基因的转录水平，它的单位是logCPM，其中CPM是counts per million的缩写，如下所示：
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Y轴则是表示在正常样本与突变样本之间，差异基因的差异程度有多大，单位是logFC，即log(fold change)，如下所示：
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此时我们已经找到了感兴趣的基因（也就是差异基因），此时我们要做哪些事情呢？
第一，如果你知道你找的是什么（我的理解就是找的是具体的哪个基因），那么就要做实验，看能否验证你的假设；
第二，如果你不知道你接下来做什么，那么就你可以看一下这些差异基因集能否在某些通路上富集，如下所示：
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每个样本对于每个特定的基因，它的reads数都不同。
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