mRNA-Seq Whole Transcriptome Analysis of a Single Cell
单个细胞的mRNA-Seq全转录组分析
阅读目的
了解单细胞转录组的开篇，汤老师是基于什么做了什么，如何做的？
文献概要
下一代测序技术是转录组分析的一个新的强大工具。然而，在某些条件下，只有少量的材料可用，这需要更敏感的技术，（1）可以优选地工作到单个细胞水平。在这里，研究人员（2）描述了一个单细胞数字基因表达谱分析。仅使用一个小鼠囊胚球，研究人员的（3）mRNA-Seq检测比微阵列技术检测出75%（5,270）的基因表达，并确定了（4）至少5个读取的1753个先前未知的剪接连接。此外，在具有多个已知转录亚型的基因中，有8-19%在同一卵裂球或卵母细胞中表达（5）至少两种亚型，这明确地表明了单个细胞在整个基因组范围内的转录变异的复杂性。（6）最后，对于dicer-/-和AGO2-/-卵母细胞，我们发现与野生型对照相比，分别有1696和1553个基因异常上调，其中619个共同基因。
与微阵列比较主要从3个方面：检测深度；可变剪切；亚型；此外做了与野生型细胞做了个差异基因比较
名词背景
PGG细胞
背景知识（Introduction有介绍）
通过以壮观和前所未有的深度和准确性分析转录组，成千上万个新的转录变异/亚型被明确发现在哺乳动物的组织或器官中表达。这些进展大大加快了我们对哺乳动物细胞基因表达调控和网络的复杂性的理解。该技术通常需要毫克的总RNA进行分析，相当于数十万个细胞。然而，在某些条件下，实际上不可能获得这样数量的材料进行分析，例如。为早期胚胎发育。事实上，在小鼠早期发育过程中，当生殖系的创始群体，原始生殖细胞(PGCs)被指定并刚刚出现时，胚胎中只有大约30个PGC细胞。另一方面，即使是对于体外培养的干细胞，可供分析的细胞数量是无限的，也有局限性。例如，小鼠胚胎干细胞(ES)细胞，可能是分析最彻底的干细胞类型，被发现包含多个亚群，具有基因表达和生理学的强烈差异。
在这里，研究人员创新了一种单细胞全转录组扩增方法，允许以高效和无偏倚的方式扩增长达3kb的cDNA（8,9）。研究人员将这种改良的单细胞cDNA扩增方法与应用生物系统公司的下一代测序(NGS)技术SOLiD™系统相结合，建立了一个单细胞全转录组分析方法。在单个细胞的分辨率下检测基因表达，使我们能够提出以前不可能提出的基本生物学问题，特别是在早期胚胎发育领域，并使我们能够了解任何生物体的最小功能单元——单个细胞的生物学。
转录组测序：需要毫克的总RNA进行分析，相当于数十万个细胞。
（1）优点：发现大量转录变异/亚型加快哺乳动物基因表达调控和网络复杂性的理解
（2）缺点：需要大量的细胞（至少mg级，10万个），许多研究没法做
新方法特点：允许以高效和无偏倚的方式扩增长达3kb的cDNA（单细胞全转录组扩增方法）
实验方法：将这种改良的单细胞cDNA扩增方法与应用生物系统公司的下一代测序(NGS)技术SOLiD™系统相结合，具体扩增过程见文章流程图。
研究意义：建立了一个单细胞全转录组分析方法。在单个细胞的分辨率下检测基因表达，使我们能够提出以前不可能提出的基本生物学问题，特别是在早期胚胎发育领域，并使我们能够了解任何生物体的最小功能单元——单个细胞的生物学。
结果
研究人员将SOLID™猝灭数据与约80个四细胞期胚胎（320个囊胚球）的微阵列进行了比较，发现Affymetrix基因芯片小鼠基因组430 2.0 阵列检测到的6733个基因也通过SOLID™测序检测到。SOLiD只能检测到通过芯片检测到的317个基因。然而，这些基因的表达相对较低，它们可能是由于杂交而被检测到的。SOLiD™测序检测到比微阵列多出4877个基因。
结论
总之，研究人员建立了一种基于单细胞分辨率的SOLiD™序列的基因表达谱分析方法。研究人员证明了数千个基因在同一细胞中表达两个或更多以上的转录变异。研究人员还证明了在dicer敲除的成熟卵母细胞中，许多转座子和重复元件的转录本异常上调。（意义）这种单细胞测序分析将极大地促进我们理解哺乳动物发育过程中转录组的复杂性，特别是在干细胞和早期胚胎发育领域。
点评
汤老师发明了一种新方法，不仅解决了细胞少的样本无法进行转录组测序之外，还由对组织的认知Zoom in细胞的认知，使人们能够在单个细胞的分辨率下检测基因表达，使研究人员能够提出之前不能提出的问题，更好的认识哺乳动物发育过程中转录组的复杂性。直接推动了人们对于医学认知的手段，对于医学研究具有重要意义。
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