illumina nextera Tn5 和ATAC seq a

下面是ATAC-seq的工作原理，想必听说过ATAC-seq的，对这个图都会再熟悉不过了。

image1.png image2.png

放大tn5:

在tn5二聚体里面的双链的Oligo是Nextera Tn5 binding site，19个碱基，全部都是一样的。伸出来的部分是单链的序列，蓝色：Nextera tn5 read1 (5'-TCGTCGGCAGCGTC-3')；红色：Nextera tn5 read2(5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3')

image3.png

1. Nextera Tn5 binding site (19-bp Mosaic End (ME)): 5'- AGATGTGTATAAGAGACAG -3’
2. Nextera N/S5xx primer entry point (s5)／Tn5 Read 1: 5'- TCGTCGGCAGCGTC -3'
3. Nextera N7xx primer entry point (s7)／ Tn5 Read 2: 5'- GTCTCGTGGGCTCGG -3'
4. Illumina P5 primer 1: 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3'
5. Illumina P7 primer 2: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3’
6. Tn5 Read 1 （包括ME）sequence: 5'- TCGTCGGCAGCGTC（AGATGTG，TATAAGAGACAG） -3’ （33bp）
7. Tn5 Read 2 （包括ME）sequence: 5'- GTCTCGTGGGCTCGG（AGATGT，GTATAAGAGACAG ）-3’ （34bp）

下面的图片就是准备ATAC-seq时候需要用到的index primer （adaptor），和Nextera DNA library prep kit里的有一点类似，但是也很不同。Ad1_noMX是Forward 引物，没有index （barcode），所以只有一个。Reversed引物有24个Ad2.（1-24），所以有24组不同的index （barcode）序列。这个index序列是和Nextera一样的。我涂红色部分就是index序列的反向反义序列，每个index序列是不同的8个碱基，这个和Nextera的i7（部分一样，请自己对照）是一样的。

image4.png

i5 sequence: ATAC-seq的Adaptor1 里没有barcode，但我这里加上了

1. 所以，ATAC-seq的这个Oligo designs （Adaptors）可以大概总结：

有两种Adaptors，分别为Adaptor1 （50bp） 和Adaptor2 （53bp）。

其中Adaptor1（5’ illumina Primer1 sequence （29bp）+ Tn5 Read1 sequence（14bp）（再延伸到ME里面7bp）3’），Adaptor2（5’ illumina Primer2 sequence（24bp）+ barcode sequence （8bp）+ Tn5 Read2 sequence （15bp）（再延伸到ME里面6bp）3’）

这样算来，ATAC-seq library的长度=左面（Adaptor1 长度 +剩余部分Tn5的ME（12 bp_TATAAGAGACAG））+ open chromatin 的DNA长度+右面（剩余部分Tn5的ME（13bp_GTATAAGAGACAG）+ Adaptor2 长度）=open chromatin 的DNA长度 + 128bp。

所以，在ATAC-seq的libraries中 mono nucleosome的ATAC-seq library长度大概是(单核小体146bp+核小体free region)+两端的adaptor及Tn5最里面部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=274bp+free region，也就是bioanalyzer里面看到的第二个peak。图中显示大概是340bp左右。所以free region应该是330bp-274bp=56bp 。

那么会问，对不对呢？看下bioanalyzer的第一个peak，显示是182bp，这个peak代表的是nucleosome free region的ATAC-seq library，所以是nucleosome free region序列长度 + 两端的adaptor及Tn5部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=182， 所以，不难得出同样的结果，nucleosome free region序列长度是54bp。差不多哦

以此类推，第三个peak代表de-nucleosome ， 500bp到550 bp之间，是不是等于两个核小体长度加上核小体空隙序列再加上两个adaptor， 2146bp + 255bp + 128bp= 530bp （为什么55bp也要乘2？答：多出来一个核小体当然就多出来一份核小体空隙）

综上所述，ATAC-seq library长度比genome DNA实际长度一定多出128bp。

image5.png

nucleosome free region, mono-nucleosome, de-nucleosome and try-nucleosome

2. 下面一个问题，tagmentation时候，会出现gap？Nextera tagmentation on amplified cDNA (will create 9-bp gap）？

“GAP不是服装品牌，而是个坑”。

image6.png

所以需要在PCR第一步，需要5min的72摄氏度来填坑。还要注意，就是在tagmentation的时候会出现三种产物，上面的图只是其中一种。

image7.png

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参考：https://www.plob.org/article/11443.html