刘小泽写于19.9.9、9.11
动力来自偶然间看到的Bioconductor放出的单细胞数据分析教程
https://bioconductor.org/packages/release/workflows/html/simpleSingleCell.html
题目就叫“step-by-step”，最喜欢这么系统的学习了，并且它涵盖了主流的几个R包，主流的两个平台smart-seq2和10X，带着读者一点点去探索scRNA公共数据。所以，你心动了没？
来吧，一起去探索！
前言
这个教程写的非常详细，所以大家可以随时自行演练，我也是凭借兴趣想要去了解这个教程。依然不是翻译
总共有12章：
| HTML | R Script | 01. Introduction |
|---|---|---|
| HTML | R Script | 02. Read count data |
| HTML | R Script | 03. UMI count data |
| HTML | R Script | 04. Droplet-based data |
| HTML | R Script | 05. Correcting batch effects |
| HTML | R Script | 06. Quality control details |
| HTML | R Script | 07. Spike-in normalization |
| HTML | R Script | 08. Detecting doublets |
| HTML | R Script | 09. Advanced variance modelling |
| HTML | R Script | 10. Detecting differential expression |
| HTML | R Script | 11. Scalability for big data |
| HTML | R Script | 12. Further analysis strategies |
还等什么？快点开始第一章的学习啦！
第一章：序幕
教程在：https://bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/simpleSingleCell/inst/doc/intro.html，更新于2019-05-03，这个教程基于的环境是R version: R version 3.6.0 (2019-04-26)； Bioconductor version: 3.9
作者也是先讲述了他写作的动力
单细胞测序，顾名思义就是对生物体内的单个细胞进行测序。整个测序过程主要有三部分：第一是单个细胞分离；第二是DNA/RNA提取；第三是测序。单个细胞分离的方法主要包括：微流控平台，如Fluidigm C1（Pollen et al. 2014）；微量滴定板，如Smart-seq2（Picelli et al. 2014）；基于微滴技术，如inDrop（Klein et al. 2015; Macosko et al. 2015）。定量的步骤加入了一个新名词：unique molecular identifiers (UMIs) ，它是为了减轻PCR bias的影响(Islam et al. 2014)。表达矩阵可以用来检测高变异基因highly variable genes (HVGs) ，它一般是细胞异质性的来源；可以寻找基因和细胞表型的关联；可以通过降维、聚类来鉴定新的亚群。这些信息在常规转录组的分辨率下是检测不到的。
scRNA-seq与bulk RNA-seq的不同之处在于：首先scRNA的数据噪音更大(Brennecke et al. 2013; Marinov et al. 2014)。由于单个细胞中的RNA含量很低，dropout的比例会更高（dropout就是原本有表达量但没检测到），因此转录本的捕获、扩增方法需要更优化，在质控时就要注意drouput的情况。scRNA-seq数据可以用来研究细胞间异质性，例如鉴定新的细胞亚群、区分不同的生物过程、将细胞对应到不同细胞周期、鉴定HVGs等 (Vallejos, Marioni, and Richardson 2015; Fan et al. 2016; Trapnell et al. 2014)。因此单细胞转录组数据需要新的方法去分析。
利用Bioconductor来学习scRNA-seq
整个学习过程是从一个表达矩阵开始的，向下有几个关键的步骤：
- 质控移除有问题的细胞
- 对细胞差异进行归一化（考虑spike-in的影响）
- 批次效应校正
- 根据基因表达量对细胞周期进行推断
- 数据探索，能否鉴定出新的亚群
- 最后，HVG与marker基因的鉴定，这些使我们更关心的基因
这些操作会使用公共数据集进行探索，这些数据集主要来自于不同实验方法和平台的骨髓祖细胞、脑细胞、造血干细胞、T辅助细胞和小鼠胚胎干细胞（Lun et al. 2017; Wilson et al. 2015; Zeisel et al. 2015; Islam et al. 2011; Buettner et al. 2015; Zheng et al. 2017）。目的是日后能对自己的数据设计个性化分析流程。
这些流程都在一个数据包中：
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("simpleSingleCell")
browseVignettes("simpleSingleCell")
获取表达矩阵
这里作者没有介绍表达矩阵的上游处理（比对、定量等），不过如果使用R进行处理的话，一般推荐Rsubread 这个包 (Liao, Smyth, and Shi 2013, 2014)。
不同的scRNA-seq方法有不同的技术手段：
- UMIs：具有相同UMI的reads比对到一个基因，这个转录本的表达量只计算一次。处理包含UMI的数据（例如10X数据）就需要从每个read或read pair中提取出UMI序列，然后将UMI重复的序列合并成一个count值 (Smith, Heger, and Sudbery 2017)
- cell barcode：测序的时候一般会同时测不同类型的样本，为了区分不同的细胞就给细胞加上一个识别码”cell barcode“。这些序列都是有标准规定的，例如Illumina就提供这种序列。基于droplet技术的实验(Zheng et al. 2017)或者非常高通量基于细胞板的实验，如MARS-seq (Jaitin et al. 2014)都适用。处理这种数据，一般需要一步操作：从每个read中提取barcode序列，然后barcode相同的就来自同一个细胞文库
像这样的预处理， scPipe 包(Tian et al. 2018) 就提供了R处理流程，不过现在10X的cellranger已经有一个比较完善的流程去做count这一步
如果存在spike-inRNA，这些序列就要在比对前（构建基因组index）的时候加上去。然后后面定量之前，spike-in转录本和内源基因的基因组区间可以合成一整个GTF文件
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