【背景摘要】
功能组织的生物打印可以克服组织短缺的问题，并可以更快地响应治疗。然而，尽管最近在生物打印方面取得了进展，并且其以精确的3D方式定位细胞和生物材料的出色能力，由于构建体向功能组织的不充分成熟，其成功受到了限制。最近，瑞士苏黎世联邦理工学院Marcy Zenobi‐Wong
教授团队提出了一种基于因子XIII激活级联的新型钙触发酶交联（CTEC）水凝胶机制，用于生物墨水，并将其用于软骨构造的生物制造。相关论文以题为Bioprinting of Cartilaginous Auricular Constructs Utilizing an Enzymatically Crosslinkable Bioink发表在《先进功能材料》上。透明质酸转谷氨酰胺酶（HA‐TG）是一种酶学上可交联的材料，显示出优异的软骨形成特性，并为CTEC生物墨水奠定了基础。生物墨水通过新软骨形成和高达400 kPa的结构硬化来支持组织成熟。生物印记的构建体在体内保持稳定24周，而生物印记的耳廓构建体转化为软骨移植物。当前研究的主要局限性在于胶原蛋白I的沉积，表明其趋向于纤维软骨而不是弹性软骨。因此，将成熟过程转向弹性软骨将是必不可少的，以便使已开发的生物墨水为小眼症患者提供新颖的组织工程疗法。CTEC生物打印技术进一步开放了可酶交联的生物聚合物及其模块性以支持多种组织的使用。
【主图见析】
图1 CTEC机制的工作原理示意图及其在生物打印中的应用。a）顶部：FXIII的激活级联。FXIII的A2B2四聚体通过凝血酶裂解其激活肽而从其酶原形式转化为酶促形式，从而形成A'2B2四聚体。在钙离子存在下，构象变化导致A’和B亚基解离，从而揭示A’亚基的催化结构域（活性A*2二聚体）。下图：说明HA‐TG的Ca2+触发的酶促交联（CTEC）生物打印过程。FXIII和凝血酶与HA‐TG混合。由于FXIII以其A'2B2四聚体形式存在，因此不会发生交联。一旦添加钙离子，FXIII就被激活并在TG底物肽之间形成键。b）生物打印和随后的成熟过程的图示。HA‐TG与HA以及相应的纳米原纤维结合在一起，并充满细胞FXIII和凝血酶，形成生物墨水。印刷后的生物印刷构建体浸没在含Ca2+的溶液中，以使离子扩散到构建体中，继而激活FXIII并导致构建体交联。最终，细胞增殖并用致密的细胞外基质填充细胞外空间。c）生物墨水的开发阶段。阶段1：通过流变学评估了生物墨水的成分的可印刷性，并开发了两种生物墨水。测试每种生物墨水与人耳软骨细胞的生物相容性。第2阶段：长达24周的体内评估，并与体外组织成熟度进行比较。第三阶段：打印耳廓构造并测试其组织成熟度。
图2 HA‐TG生物油墨中的CTEC交联性，可印刷性和组织成熟度。a）CTEC：与含FXIII和凝血酶但不含钙的HA-TG（1.5％HA-TG –无Ca2+）和HA相比，HA-TG与外部施加的10μL 1 m CaCl2（1.5％HA-TG）的交联‐TG与CNF（1.5％HA‐TG – 2％CNF）或sNAG（1.5％HA‐TG – 2％sNAG）纳米原纤维混合，并通过外部添加10μL 1 m CaCl2进行交联。b）CNF和sNAG生物墨水的外部交联是通过在样品周围放置500μL 100×10-3 m CaCl2引发的。c）剪切稀化和d）生物墨水的剪切恢复行为。e）传输纳米原纤维的电子显微镜图像。f）在100×10-3 m CaCl2中交联之前和之后的生物印染耳朵的照片。g）从在体外培养的样品的应力-应变曲线计算出的压缩模量。h）从样品表面直至100 µm的样品中获得的整个z堆栈的活力进行了分析。i）样品中25 µm的代表性生存力和二次谐波生成（SHG）图像。j）与人耳软骨相比，GAG（番红O），I型胶原，II型胶原和弹性蛋白的圆柱形样品的组织学和免疫组织学染色。
图3 生物打印和体内新软骨形成。a）样品中25 µm的代表性生存力和SHG图像。比例尺100 µm。b）分析从样品表面直至100 µm的样品在整个z堆栈中的生存力。c）左上：在皮下植入构建体后立即拍摄的照片。右上图：图片显示伤口已愈合，仅留下小疤痕。下图：体内植入24周后（共27周）在结构植入过程中拍摄的照片。红色箭头指示构建体的位置。d）在不同时间点的体外和体内样品的图片。e）根据在相应时间点从体外和体内样品获得的应力应变曲线计算出的压缩模量。f）植入后和安乐死前获得的超声（上）和光声（下）图像。下排图像显示了超声和氧饱和度的叠加。g）与人耳软骨相比，GAG（番红O），I型胶原和II型胶原的组织学和免疫组织学染色。
图4 5周后，在生物打印的耳廓构造中形成体外新软骨。a）用于这项研究的耳廓的3D模型，并标记了耳廓的所有界标。b）沿其矢状面切耳朵。将机械性能映射到内侧部分，而外侧部分用于组织学。c）耳廓3D模型的壁厚分析。d）用于压缩测试和压痕映射的测量点。绿点：压缩测试，红点：压痕映射。在每个位置进行3次压痕测量。e）耳朵和生物打印机的照片。f）从压痕曲线计算出的不同测量点的赫兹模量，如d所示。g）耳廓软骨基质成分的组织学和免疫组织学分析。
参考文献：
doi.org/10.1002/adfm.202008261
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